СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L- АРГИНИНА, ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ И МЕТИОНИНА ИЗ ЖМЫХА СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА Российский патент 2022 года по МПК C12P13/10 C12P13/12 C12P13/14 C12R1/15 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения аминокислот: L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина ферментацией пищевых отходов.

Обычно L-аминокислоты производятся в промышленности методами ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов.

Обычно микроорганизмы модифицируют для увеличения выхода L-аминокислот.

Экономичность способа получения аргинина, глутаминовой кислоты и метионина из источников нерафинированного сахара можно повысить путем замены дорогих синтетических источников углерода, таких как глюкоза или сахароза.

L-аргинин является условно незаменимой аминокислотой ввиду зависимости от стадии развития и состояния здоровья индивидуума. Аргинин стимулирует иммунную систему посредством увеличения выхода Т-клеток, способствует расширению кровеносных сосудов, поддержанию здоровья мышечной системы, удалению аммиака из тела и выработке гормонов. Производство L-аргинина осуществляется тремя традиционными способами: экстракцией из белковых гидролизатов; химическим синтезом, ферментативным гидролизом.

Фармакологический препарат метионина оказывает некоторое липотропное действие, повышает синтез холина, лецитина и других фосфолипидов, в некоторой степени способствует снижению содержания холестерина в крови и улучшению соотношения фосфолипиды/холестерин, уменьшению отложения нейтрального жира в печени и улучшению функции печени, может оказывать умеренное антидепрессивное действие (по-видимому, за счёт влияния на биосинтез адреналина).

S-аденозил-метионин (Адеметионин, SAMe, гептрал, гептор) оказывает более сильное положительное действие на функцию печени и более выраженное антидепрессивное действие, чем метионин. В фармакологии используется как стимулятор регенерации печени, антифибротик, антихолестатик, антидепрессант. В эксперименте показана антифибротическая (противорубцовая) активность адеметионина.

Метил-метионин-сульфоний (в фармакологии известен как «метиосульфония хлорид»), иногда условно называемый «витамином U» (от лат. ulcus — язва), обладает выраженным цитопротективным действием на слизистую желудка и двенадцатиперстной кишки, способствует заживлению язвенных и эрозивных поражений слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки.

Глутамат натрия — натриевая соль глутаминовой кислоты — наиболее важный возбуждающий нейротрансмиттер в биохимических процессах в нервной системе позвоночных. В химических синапсах глутамат запасается в пресинаптических пузырьках (везикулах). Нервный импульс активирует высвобождение иона глутаминовой кислоты из пресинаптического нейрона. На постсинаптическом нейроне ион глутаминовой кислоты связывается с постсинаптическими рецепторами, такими, как, например, NMDA-рецепторы, и активирует их. Благодаря участию последних в синаптической пластичности ион глутаминовой кислоты участвует в таких функциях высшей нервной деятельности как обучение и память. Одна из форм приспособляемости синапсов, называемая долговременной потенциацией, имеет место в глутаматергических синапсах гиппокампа, неокортекса и в других частях головного мозга человека. Глутамат натрия участвует не только в классическом проведении нервного импульса от нейрона к нейрону, но и в объёмной нейротрансмиссии, когда сигнал передаётся в соседние синапсы путём кумулятивного эффекта глутамата натрия, высвобожденного в соседних синапсах (так называемая экстрасинаптическая или объёмная нейротрансмиссия). В дополнение к этому, глутамат играет важную роль в регуляции конусов роста и синаптогенеза в процессе развития головного мозга, как это было описано Марком Мэтсоном.

Позднее было обнаружено, что аминокислоты можно получить ассимиляцией углеводородов штаммами дикого типа Corynebacterium и Brevihacterium (патенты США №3222258 и 3440141) и эти штаммы производят еще большее количество аминокислот из углеводов (патент Великобритании № 1278917).

Среди регуляторных мутантов различных микроорганизмов Cotymbacterium glutamicum показал наиболее высокую способность производства аминокислот. Некоторые из наиболее типичных мутантов, продуцирующих аминокислоты, относятся к виду Corynebacterium, устойчивому к 2-тиазолаланину (патент США № 3723249 и патент США № 3878044) и канаванину (патент США № 3849250; Патент Великобритании № 1351518). Кроме того, было обнаружено, что мутанты вида Bacillus (Патент США №3734829, патент США № 4086137 и патент США № 4430430) и Escherichia (патент США № 4430430, патент США № 6897048) также производят аминокислоты в значительных количествах.

Как известно, кислородное питание оказывает большое влияние на аэробное производство аминокислот микроорганизмами (Takishi Utagawa, "Production of Arginine by fermentation," J. Nutr. 134:2854S-2857S (2004)). Рост в анаэробных условиях часто приводит к образованию токсичных побочных продуктов, таких как уксусная кислота и этиловый спирт, которые, в свою очередь, приводят к сильному замедлению производства аминокислот (J. Gong, J. Ding, H. Huang, Q. Chen, Kinetic study and modeling on L-arginine fermentation, Chin. . Biotech. 9 (1) 9 -18 (1993)).

К некоторым из недостатков существующего процесса ферментации аминокислот относятся, например, отсутствие культур дикого типа, способных к производству аргинина, в отличие от глутамата, где штамм дикого типа С.glutamicum способен к производству в больших объемах. Кроме того, затруднения вызывает получение ауксотрофных мутантов, способных к производству аргинина, и существует необходимость в генной инженерии для улучшения подходящих для производства аргинина штаммов. Более того, себестоимость производства аргинина относительно высока в связи с использованием чистой глюкозы как единственного источника углерода. Таким образом, предпочтительны недорогие альтернативы для повышения количества выхода продукции с использованием имеющихся штаммов.

Из уровня техники известен документ (RU 2557294 C2, 2007.2015), выбранный нами в качестве прототипа. В данном документе раскрыт способ получения аргинина ферментацией агроотходов, включающий: ферментацию сельскохозяйственных отходов в присутствии по меньшей мере одного из Cotynehacterium glulamicum ATCC 21831 или Cotynehacterium glulamicum ATCC 21493 для получения ферментированной жидкости, содержащей аргинин; а также извлечение аргинина из сброженного раствора. Агроотходы содержат источник углерода, получены путем гидролиза крахмалсодержащих материалов с осахаривающим крахмал ферментом, где крахмалсодержщие материалы выбраны из жома, порошка семян, жома маниоки и/или порошка семян джекфрута. Ферментация представляет собой аэробную ферментацию, ферментация может проводиться в диапазоне температур от 20° С до 50°С, при значении рН от 5 до 8, в течение от 12 часов до 2 недель. Способ дополнительно включает добавление лактамного антибиотика во время ферментации.

Вышеописанный способ имеет ряд недостатков: используемое в нем сырье (маниока и джейфрут) невозможно получить в Российской Федерации и соответственно отходы этого сырья недоступны для производства аргинина и других аминокислот. Также используемые авторами бактерии не позволяют ферментировать цельную суспензию жмыха (жома), а требуют предварительной обработки жома ферментом амилазой. Также, в составе конечного продукта содержатся лактамные антибиотики, что значительно удорожает технологию. Кроме того, использование способа по прототипу не обеспечивает высокий выход аминокислот.

Указанные проблемы решаются тем, что вместо двух мутантных штаммов Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 и Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 мы используем известный, недорогой и хорошо изученный штамм Corynebacterium glutamicum R. Также вместо сырья на основе маниоки и джейфрута мы используем обычную подсолнечную макуху (жмых семян подсолнечника), доступную по всей территории Российской Федерации и не используем процесс предварительной ферментации, что значительно удешевляет технологию производства. Также, замена лактамных антибиотиков в нашем изобретении на пищевой консервант низин, к которому резистентен штамм Corynebacterium glutamicum R, позволяет не только предотвратить контаминации реакционной биотехнологической среды, но и позже трипсином полностью разрушить низин и исключить примеси в конечном продукте антибиотических препаратов.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка экономически более дешевого и эффективного способа получения аргинина, метионина и глутаминовой кислоты из отечественного сырья, с применением известного и недорого штамма микроорганизма, а также расширение арсенала способов получения аминокислот из агропромышленных отходов.

Поставленная задача достигается посредством способа ферментации агропромышленных отходов- жмыха (жома, макухи) семян подсолнечника, состоящий из: ферментации суспензии жмыха семян подсолнечника в воде в присутствии Corynebacterium glutamicum штамма R.

Техническим результатом изобретения является создание более экономного способа получения аминокислот: L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина (на 30-40% экономней в сравнении с прототипом) с повышенным выходом аминокислот (на 12-15% в сравнении с прототипом), при использовании более дешевого и доступного сырья, жмыха (макухи) семян подсолнечника.

Технический результат достигается за счет осуществления способа получения аминокислот: L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина из пищевых отходов, включающий ферментацию пищевых отходов в присутствии Corynebacterium glutamicum в аэробных условиях до получения ферментированной жидкости, содержащей аминокислоты, характеризующийся тем, что для получения L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина проводят ферментацию суспензии жмыха семян подсолнечника в воде с долей суспензионного порошка от 0,5 до 30 вес% в присутствии штамма Strain R Corynebacterium glutamicum, при pH от 6,0-8,0, температуре 25-40°C в течение от 3 до 15 дней.

Для осуществления изобретения использовался штамм Corynebacterium glutamicum- Strain R известный из документа-("Comparative analysis of the Corynebacterium glutamicum group and complete genome sequence of strain R." Yukawa H., Omumasaba C.A., Nonaka H., Kos P., Okai N., Suzuki N., Suda M., Tsuge Y., Watanabe J., Ikeda Y., Vertes A.A., Inui M. Microbiology 153:1042-1058,(2007).

Технический результат достигается за счет оптимально подобранных условий способа: ферментации водной суспензии жома семян подсолнечника с долей суспензионного порошка от 0,5 до 30 вес% в присутствии штамма Strain R Corynebacterium glutamicum, при pH от 6,0-8,0, температуре 25-40°C в течение от 3 до 15 дней.

Дальнейшее описание подробно характеризует предложенное изобретение и то, каким образом оно должно быть выполнено.

Предложен микробиологический синтез L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты с использованием производственной среды, содержащей субстрат крахмалосодержащих сельскохозяйственных отходов, такой как жмых семян подсолнечника (макуха), полученный после отжима масла, или его гидролизат, в качестве основного источника углерода, с использованием штамма R Corynebacterium glutamicum.

Характерным вариантом осуществления настоящего изобретения является использование гидролизатов суспензии жмыха (макухи) подсолнечника, из локально доступных агропромышленных отходов, для замещения чистых сахаров, для взращивания штамма R Corynebacterium glutamicum, способного к производству аминокислот.

Еще одним дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения является очистка L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты от ферментированной жидкости после ферментации, их выделения из ферментированной жидкости, известными методами.

В соответствии с характерным вариантом осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты посредством ферментации агропромышленных отходов, состоящий из: ферментации агропромышленных отходов в присутствии, Corynebacterium glutamicum Strain R до получения ферментированной жидкости, содержащей L-аргинин, метионин и глутаминовую кислоту.

В соответствии с другим характерным вариантом осуществления настоящего изобретения, предложен способ получения L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты из агропромышленных отходов-жмыха семян подсолнечника, включающий: ферментативную гидролизацию жмыха семян подсолнечника предпочтительно такого, что от 55 до 85%, предпочтительно от 60% до 75% и более предпочтительно от 65 до 68% субстрата агропромышленных отходов перерабатывается в восстанавливающие сахара; ферментацию восстанавливающих сахаров (предпочтительно, в качестве единственного источника углерода) в присутствии Corynebacterium glutamicum Strain R до получения ферментированной жидкости, содержащей аргинин, метионин и глутаминовую кислоту; и выделение этих аминокислот из ферментированной жидкости.

Эти и другие характерные особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания.

Используемые здесь слова «предпочтительный» и «предпочтительно», относятся к вариантам осуществления изобретения, которые при определенных условиях предоставляют определенные преимущества. Однако другие варианты осуществления изобретения также могут быть предпочтительными при аналогичных или иных условиях. Применяемые диапазоны значений подразумевают, что любое значение в пределах диапазона может быть выбрано.

Если не указано иное, все процентные содержания и количества вещества, следует относить к процентам, исчисляемым от веса. Данные количества вещества основаны на активном весе вещества. Перечисленные здесь конкретные значения, относящиеся к соответствующему количеству компонентов или других признаков различных вариантов осуществления изобретения, даны для обозначения этого значения плюс-минус степень изменчивости для учета ошибок в измерениях. Например, величина в 10% может включать 9,5% или 10,5% с учетом степени погрешности в измерениях, которые будут оценены и понятны специалисту в данной области.

Известно использование агропромышленных отходов в качестве основного источника углерода для различных выработок микробных метаболитов, таких как ферменты, органических кислот, таких как молочная кислота, пигментов.

Авторы настоящего изобретения считают, что биотехнологические способы получения аминокислот из дешевого сырья могут быть улучшены в дальнейшем для того, чтобы сделать их конкурентоспособными по отношению к способам химического получения.

Авторами изобретения был выбран один субстрат, принимая во внимание высокое содержание в нем крахмала– жмых (жом, макуха) семян подсолнечника, полученный после отжима масла. Количество сырья- семян подсолнечника, для производства, на всей территории России является достаточным, для обеспечения производства L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты в любом регионе.

Макуха (жмых после отжима семян подсолнечника и получения подсолнечного масла)

Макуха или жмых после отжима семян и получения подсолнечного масла представляет собой высокобелковый концентрированный корм, он также является отходом производства подсолнечного масла. Его получают в результате холодного отжима семян подсолнечника. Жмых включают в рацион большинства сельскохозяйственных животных. Его используют для производства комбикормов или непосредственно вводят в рацион животных Весьма широко распространён, доступен для использования и стоимость его довольно низкая. Он рассматривается, прежде всего, как ценный источник белка.

Содержание протеина в данном виде подсолнечного жмыха составляет 38%. По качеству белка жмых значительно опережает зерно злаковых культур. Подсолнечный жмых богат клетчаткой (до 20% по массе на абсолютно сухое вещество), которая повышает перевариваемость пищи и необходима в рационах всех животных.

Энергетическая питательность 1 кг подсолнечного жмыха*:

Кормовые единицы 1,05 Энергетическая кормовая единица (ЭКЕ) для КРС 1,10 Энергетическая кормовая единица (ЭКЕ) для свиней 1,16 Энергетическая кормовая единица (ЭКЕ) для овец 1,10 Обменная энергия для КРС, МДж 11,02 Обменная энергия для свиней, МДж 11,65 Обменная энергия для овец, МДж 11,00 Сухое вещество, г 920,00 Сырой жир, г 155,00 Сырая клетчатка, г 210,00 Нейтрально-детергентная клетчатка (НДК), г 224,70 Безазотистые экстрактивные вещества (БЭВ), г 58,30 Крахмал, г 46,00 Сахар, г 3,60

Протеиновая питательность 1 кг подсолнечного жмыха*:

Сырой протеин, г 320,00 Переваримый протеин (ПП) для КРС, г 256,00 Расщепляемый в рубце протеин (РРП), г 176,00 Нерасщепляемый в рубце протеин (НРП), г 144,00 Переваримый протеин (ПП) для свиней, г 272,00 Переваримый протеин (ПП) для овец, г 300,00 Лизин, г 11,60 Метеонин+цистин, г 13,20

Минеральный состав 1 кг подсолнечного жмыха*:

Кальций, г 6,50 Фосфор, г 9,10 Магний, г 5,80 Калий, г 13,50 Сера, г 4,00 Железо, мг 164,80 Медь, мг 17,20 Цинк, мг 40,00 Марганец, мг 38,00 Кобальт, мг 0,19 Йод, мг 0,37

Витаминный состав 1 кг подсолнечного жмыха*:

Каротин, мг 2,00 Витамин Д, МЕ 4,90 Витамин Е, мг 5,00 Витамин В1, мг 4,20 Витамин В2, мг 3,60 Витамин В3, мг 13,60 Витамин В4, мг 2000,00 Витамин В5, мг 215,00

Качественная характеристика протеина экструдированного подсолнечного жмыха (в среднем по России):

Содержание протеина (%) сырой (общий) протеин 39,4 растворимый протеин 24,9 расщепляемый протеин 47,9

Аминокислоты, в грамм в абсолютно сухом веществе:

треонин 14,5 валин 20,3 метионин 4,3 изолейцин 16,7 лейцин 24,7 фенилаланин 17,2 гистидин 11,5 лизин 12,6 аргинин 25,3 триптофан 4,1 Всего аминокислот 348,1 в том числе незаменимых 151,1

* - приведены средние данные по Центральному ФО. (Кормовые ресурсы животноводства. Классификация, состав и питательность кормов: научное издание. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2009).

Как видно из вышеуказанного состава, подсолнечный жмых содержит практически все компоненты, необходимые для жизнедеятельности бактерии. Особенно богат он на углеводы и белки. Именно эти два показателя являются существенными для производства L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты штаммом Corynebacterium glutamicum R.

L-аргинин, метионин и глутаминовая кислота, могут быть получены посредством ферментации агропромышленных отходов, таких как описано выше, в присутствии микроорганизмов штаммом Corynebacterium glutamicum R для производства смеси, содержащей аминокислоты, а затем, в случае необходимости, отделением отдельно каждой аминокислоты из смеси.

Предпочтительно, культуры содержатся в LBG среде (Бульон Луриа-Бертрани, дополненный глюкозой) и пересеиваются каждые две недели. В настоящем изобретении предпочтительно, что культуральной средой являлась естественная среда, содержащая предпочтительное количество источников углерода, источников азота, неорганических солей и небольшие количества незначительных неорганических питательных веществ, необходимых для роста штаммов. Предпочтительные источники углерода в настоящем изобретении включают глюкозу или гидролизаты крахмала крахмалосодержащего материала- макухи подсолнечника, полученные ферментативным гидролизом с использованием подходящих осахаривающих крахмал ферментов.

Ферменты, осахаривающие крахмал, известны из уровня техники. Такие ферменты включают, например, амилазу, глюкоамилазу, пуллуланазу, Corticium rolfsii AHU 9627, и подобные. Процесс гидролиза может быть оптимизирован для каждого субстрата с помощью методов, известных в данной области техники, наряду с описанными здесь методическими рекомендациями.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения ферментация гидролизатов крахмала жмыха семян подсолнечника обеспечивает больший выход, по сравнению с ферментацией чистых сахаров, таких как декстроза, при использовании тех же микроорганизмов.

В качестве источников азота могут быть использованы неорганические соли азота, такие как хлорид аммония и другие традиционные органические источники азота, такие как Nz-амин, гидролизат казеина, жидкий кукурузный экстракт и т.д. Предпочтительно, могут быть использованы неорганические соли, такие как моногидрофосфат калия, дигидрофосат калия, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция, и т.д. Небольшое количество таких веществ, как биотин и тиамин, также может быть добавлено в среду во всех случаях, когда это требуется в настоящем изобретении.

Культивирование осуществляют в аэробных условиях, созданных перемешиванием или встряхиванием. Например, культивирование клеток в лабораторных условиях может осуществляться аэробно в погруженных в воду 250 мл колбах Эрленмейера в ротационном шейкере с подходящим перемешиванием. Специалисты в данной области способны масштабировать данный процесс для получения L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты в коммерческих масштабах.

Температура инкубации может быть в пределах от 25°C до 40°C, более предпочтительно от 27°C до 36°C, и наиболее предпочтительно от 30°C до 32°C. При использовании температуры, ниже 25°C бактерии практически не размножаются и реакция идет длительное время, что является экономически невыгодным. При температуре выше 40°C бактерия погибает и процесс ферментации не происходит.

Значение рН ферментации находится в пределах от 6 до 8, еще более предпочтительно от 6 до 7, и наиболее предпочтительно, чтобы поддерживался нейтральный уровень рН=7.

Дополнительно, суспензия жмыха семян подсолнечника гидролизуется трипсином или амилазой.

Амилазой является рекомбинантная амилаза, продуцируемая генно-модифицированными бактериями или грибами, или амилаза, выделенная из животного и/или растительного сырья. Трипсином является рекомбинантный трипсин, продуцируемый генно-модифицированными бактериями или грибами или трипсин, выделенный из животного и/или растительного сырья.

Незначительная (1-5 единиц) добавка лантибиотика низина (пищевого консерванта) перед началом или в процессе ферментации, предпочтительна для повышения выхода аминокислот.

Ферментация длится в течение от 3 часов до 15 дней для того, чтобы накопить достаточное количество аминокислот.

После ферментации L-аргинин, метионин и глутаминовую кислоту, содержащиеся в ферментированной жидкости, могут быть отделены, например, удалением микробных клеток и любых других осадков с помощью стандартных методов, таких как применение ионообменной смолы или осаждение.

Качественное определение L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты накопленных в культуральной жидкости (ферментированной жидкости) может быть осуществлено с помощью тонкослойной хроматографии и количественного ВЭЖХ после дериватизации дансилхлорида.

Частичная очистка и восстановление L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты могут быть стандартизированы с помощью сильнокислотной катионообменной смолы, такой как Amberlite.

Нижеприведенные конкретные примеры, показывающие варианты осуществления изобретения, предусмотрены лишь с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Варианты осуществления изобретения

Пример 1:

Для получения 0,5-30вес % водной суспензии жмыха подсолнечника в воду вносят расчетное количество сухого измельченного жмыха семян подсолнечника и перемешивают в мешалке до однородности и полного смачивания порошка для исключения флотации (не должен плавать по поверхности воды).

Так, например, 0,5 г измельченного жмыха семян подсолнечника вносят в 99,5 мл воды и суспендируют в мешалке или миксере до однородности. Поучают 0,5 % водную суспензию жмыха семян подсолнечника.

Пример 2:

Для получения гидролизата суспензии жмыха семян подсолнечника, в суспензию жмыха подсолнечника 0,5 вес% вносят 0,01 г трипсина и перемешивают до полного растворения трипсина. Общее время перемешивания в реакторе 3 часа. В результате образуется гидролизат суспензии жмыха подсолнечника, который пригоден для внесения бактерии и дальнейшего биотехнологического процесса.

Пример 3:

18-часовой инокулум штамма Corynebacterium glutamicum R инокулировали в ферментационную среду в композиции, содержащей трипсин/амилазный гидролизат 10 % водной суспензии жмыха семян подсолнечника, эквивалентного 5 % декстрозы, 0,05% K₂HOP₄, 0,05% KH₂PO₄, 3% (NH₄)₂SO₄, 0,025% MgSO₄·7H₂O, 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,001% MnSO₄·4 H₂O, сухих веществ в объеме раствора. Значение pH поддерживали нейтральным, равным 7. В результате инкубации, проводимой в общей сложности 100 часов при 30°C при перемешивании, конечное содержание аминокислот L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты составило 2,55 мг/мл; 1,4 мг/мл; 3,9 мг/мл, соответственно. Количество аминокислот, получаемых в течение 100-часового периода, определяли с интервалом в 24, 48, 72, 96 и 120 часов.

Суспензию макухи подсолнечника можно дополнительно прогревать при температуре для 80-95 ⁰ С для стерилизации.

Результаты показаны ниже в таблице 1:

Таблица 1. Получение аминокислот культурой C. glutamicum R в гидролизате порошка макухи

Время (ч) 24 48 72 96 100 Концентрация аргинина (мг/мл) 1,00 1,95 2,00 2,45 2,55* Концентрация метионина
(мг/мл) 0,6 0,8 0,9 1,1 1,4 Концентрация глутаминовой кислоты (мг/мл) 2,6 2,9 3,1 3,3 3,9

* В прототипе (RU2557294C2) концентрация аргинина на 120 час инкубации была максиамальной и составляла 2,27 мг/мл при наличии дополнительной ферментации и антибиотиков

Пример 4:

Для получения посевной культуры для ферментации штамм R C. glutamicum, продуцирующий L-аргинин, метионин и глутаминовую кислоту, культивировали в среде, содержащей 0,5% декстрозу, 0,5% хлорида натрия, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,2% ферментативного гидролизата казеина, при перемешивании в течение 18 часов. Ферментационную среду (25 мл) распределяли в 250 мл колбе Эрленмейера, засеивали посевную культуру и инкубировали при 32°c в ротационном шейкере. Ферментационная среда содержала 5% суспензию не гидролизованного жмыха (макухи) семян подсолнечника, эквивалентного 5% декстрозе, 0,05% K₂HOP₄, 0,05% KH₂P0₄, 3% (NH₄)₂S0₄, 0,025% MgS0₄·7H₂0, 0,001% FeS0₄·7 H₂0, 0,001% MnS0₄·4H₂0, 0,5% Nz-амина, 50 мкг/л биотина, 2 мг/л тиамина, 500 мкл жидкого экстракта кукурузы, 2% CaCO₃. Значение pH поддерживали нейтральным, равным 7. В ходе инкубации в ферментативную среду добавляли лантибиотик низин. Через 100 часов инкубации содержание аминокислот L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты составляло 2,50 мг/мл; 1,1 мг/мл; 4,1 мг/мл соответственно, что представляло собой максимальную концентрацию L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты. Количество L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты производимых в течение 100-часового периода определялось с интервалом в 24, 48, 72, 96 и 100 часов.

Результаты представлены ниже в таблице 2:

Таблица 2. Получение аминокислот культурой C. glutamicum R в суспензии порошка макухи

Время (ч) 24 48 72 96 100 Концентрация аргинина (мг/мл) 0,67 1,45 1,55 1,87 2,50* Концентрация метионина
(мг/мл) 0,3 0,4 0,4 1,0 1,1 Концентрация глутаминовой кислоты (мг/мл) 2,9 3,1 3,4 3,9 4,1

* В прототипе (RU2557294C2) концентрация аргинина на 120 час инкубации была максиамальной и составляла 2,27 мг/мл при наличии дополнительной ферментации и антибиотиков

Пример 5:

Для производства L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты посредством глубинной ферментации с использованием штамма R Corynebacterium glutamicum, инокулят подготавливали при перемешивании при 32°С в течение 18 ч в среде, состоящей из 0,5% раствора декстрозы, 0,5% хлорида натрия, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,2% ферментативного гидролизата казеина. 5% от инокулята, полученного таким образом, переносилось на 25 мл порции ферментационной среды. Вышеуказанная ферментационная среда представляет собой водную природную среду, содержащую трипсинолизный гидролизат 0,5% суспензии порошка макухи, эквивалентный 5% декстрозе, 0,05% K₂HOP₄, 0,05% KH₂P0₄, 3% (NH₄)₂S0₄, 0,025% MgS0₄·7H₂0, 0,001% FeS0₄·7 H₂0, 0,001% MnS0₄·4H₂0, 0,5% Nz-амина, 50 мкг/л биотина, 2 мг/л тиамина, 500 мкл жидкого экстракта кукурузы и 2% CaCO₃. Ферментацию проводили при 32°C в течение 100 часов. В начальной стадии инкубации добавляли лантибиотик низин. После 100 часов инкубации в ферментированной жидкости накапливались L-аргинин, метионин и глутаминовая кислота в концентрациях 2,7 мг/мл; 1,0 мг/мл; 3,1 мг/мл, соответственно. Количество аминокислот, производимых за период 100 часов, определяли с интервалом в 24, 48, 72, 72, 96 и 100 часов.

Результаты показаны ниже в Таблице 3:

Таблица 3. Получение аминокислот культурой C. glutamicum R в суспензии порошка макухи, предварительно обработанной трипсином

Время (ч) 24 48 72 96 100 Концентрация аргинина (мг/мл) 0,27 0,44 1,23 1,70 2,70* Концентрация метионина
(мг/мл) 0,2 0,3 0,3 0,9 1,0 Концентрация глутаминовой кислоты (мг/мл) 2,2 2,6 2,7 3,0 3,1

* В прототипе (RU2557294C2) концентрация аргинина на 120 час инкубации была максиамальной и составляла 2,27 мг/мл при наличии дополнительной ферментации и антибиотиков

Описанные здесь варианты осуществления изобретения обеспечивают уникальные преимущества для производства L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты, а также высокий выход L-аргинина, метионина и глутаминовой кислоты из недорогих агропромышленных отходов – жмыха (макухи) семян подсолнечника, по сравнению с выходом из чистого источника углерода, такого как декстроза, а также из отходов, согласно прототипу.

Преимуществом является использование или переработка агропромышленных отходов, таких как жмых семян подсолнечника после получения подсолнечного масла и более высокий выход основного продукта аргинина- на 12-15%. Еще одним преимуществом является высокий выход метионина и глутаминовой кислоты в среде на основе суспензии макухи в воде.

Другим преимуществом является использование альтернативного способа для сокращения использования в целях ферментации дорогостоящих рафинированных сахаров, таких как декстроза.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, а именно к способу получения аминокислот: L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина ферментацией пищевых отходов. Проводят ферментацию водной суспензии жмыха семян подсолнечника с долей суспензионного порошка от 0,5 до 30 вес.% в присутствии штамма R Corynebacterium glutamicum в аэробных условиях при pH от 6,0-8,0, температуре 25-40°C в течение от 3 до 15 дней. Получают ферментированную жидкость, содержащую аминокислоты. Изобретение позволяет получать более высокий выход L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина. 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 пр.

1. Способ получения аминокислот: L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина из пищевых отходов, включающий ферментацию пищевых отходов в присутствии Corynebacterium glutamicum в аэробных условиях до получения ферментированной жидкости, содержащей аминокислоты, характеризующийся тем, что для получения L-аргинина, глутаминовой кислоты и метионина проводят ферментацию водной суспензии жмыха семян подсолнечника с долей суспензионного порошка от 0,5 до 30 вес.% в присутствии штамма R Corynebacterium glutamicum при pH от 6,0-8,0, температуре 25-40°C в течение от 3 до 15 дней.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что водная суспензия жмыха семян подсолнечника предварительно прогревается при температуре 80-95°С.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что водная суспензия жмыха семян подсолнечника перед ферментаций дополнительно гидролизуется амилазой.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что амилазой является рекомбинантная амилаза, продуцируемая генно-модифицированными бактериями или грибами.

5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что амилазой является амилаза, выделенная из животного и/или растительного сырья.

6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что водная суспензия жмыха семян подсолнечника перед ферментацией дополнительно гидролизуется трипсином.

7. Способ по п.6, характеризующийся тем, что трипсином является рекомбинантный трипсин, продуцируемый генно-модифицированными бактериями или грибами.

8. Способ по п.6, характеризующийся тем, что трипсином является трипсин, выделенный из животного и/или растительного сырья.

9. Способ по п.1, характеризующийся тем, что он дополнительно включает добавление лантибиотика низина перед началом или в процессе ферментации.