СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов и может быть использовано при получении лечебно-профилактических бактериофагов, предназначенных для парентерального и внутривенного введения.

Препараты бактериофагов оказывают непосредственное литическое действие на микробные клетки (терапевтическое) в отличие от вакцин, требующих длительного иммунологического процесса для профилактики инфекции.

Известные способы получения бактериофагов [1 и 2] позволяют получать препараты бактериофагов, пригодных только для местного и энтерального применения (per os). Однако энтеральный способ применения эффективен в основном при локализации инфекции в желудочно-кишечном тракте, а местное применение бактериофагов обеспечивает поступление препарата лишь в поверхностные ткани, что снижает эффективность препарата лишь в поверхностные ткани, что снижает эффективность лечения. Более эффективные способы введения бактериофагов - подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутриполостной - не могут быть применены из-за побочных реакций, связанных с пирогенностью препаратов и анафилактоидными свойствами остатков питательной среды.

Поэтому в действующих фармакопейных статьях [3] на эти препараты предусмотрено только два пути введения - местный и энтеральный.

Известны способы удаления балластных веществ (остатков питательной среды, белков, метаболитов бактерий) из полуфабриката бактериофагов, например, ультрафильтрацией [2] . Однако предлагаемые способы неэффективности в отношении устранения пирогена (эндотоксинов, липополисахаридов), хотя и обеспечивают удаление части белка и балластных веществ [2 и 4]. Так 10-кратная ультрафильтрация на полых волокнах 100000 Да [4] депирогенизировала лишь 15±7,98% пирогенных серий (табл. 1). Кроме того, в литературе имеются сведения об опыте получения стафилококкового бактериофага для парентерального применения, однако его получение связано со сложным технологическим процессом и не нашло промышленного применения [5].

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу получения бактериофагов для парентерального применения является способ выделения бактериофагов [4] , включающий микрофильтрацию фаголизатов известных фагов с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией.

Задача изобретения - разработка способа получения препаратов бактериофагов, пригодных для парентерального введения.

Технический результат: устранение пирогенности и повышение эффективности препарата за счет парентерального введения, достигается тем, что ультрафильтрацию проводят на мембранах с порогом задержания 200 - 300 КДа в присутствии комплексообразователей или детергентов с их последующим удалением диафильтрацией физиологически приемлемым буфером.

В качестве комплексообразователей используют одно из следующих соединений этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТУК) в концентрации 0,002 - 0,03 М; в качестве дегергентов - твин 80, твин 20, тритон X 100 и другие подобные соединения, используемая концентрация составляет 0,05 - 1%.

Общими признаками для этих способов является микрофильтрация фаголизатов, процесс ультрафильтрации на мембранах и заключительная стерилизующая фильтрация.

Отличительными признаками предлагаемого способа получения бактериофагов для парентерального введения является применение на этапе ультрафильтрации детергентов или комплексообразователей и использование мембран с большим порогом задержания по молекулярной массе от 200 до 300 КДа (прототип 100 КДа). Введение детергентов или комплексообразователей на этапе ультрафильтрации облегчает прохождение сквозь мембрану с большим диаметром пор в фильтрат молекул эндотоксинов, денатурированных белков, липополисахаридов (ЛПС), метаболитов бактерий и питательной среды. Частицы фага, задерживаясь мембраной, переводятся в физиологически приемлемый буфер, свободный от эндотоксинов. Тем самым происходит очистка бактериофагов от пирогена, причем возможна очистка фагов как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Наличие пирогенности в последних, видимо, можно объяснить наличием эндотоксинов в питательной среде, на оборудовании, реактивах.

Как видно из таблицы, использование вновь предлагаемого способа позволяет:
провести очистку фагов от эндотоксинов;
очистить препарат от метаболитов бактерий и белков среды на 99,02±0,95% по белку разница с прототипом статистически недостоверна).

Препараты бактериофагов, полученные предлагаемым способом, не обладали токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении белым мышам в дозе, в 3500 раз превышающей максимально разовую для человека. Гибели животных, падения массы тела, патологических изменений внутренних органов не обнаружено.

Препараты бактериофагов, полученные предлагаемым способом, не обладали токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении в терапевтических дозах в течение 21 дня (хроническая токсичность).

Пирогенность бактериофагов оценивалась согласно Государственной Фармакопее СССР, 11 издание, вып. 2 [6]. Препараты бактериофагов вводились кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела внутривенно. Препарат считали апирогенным, если сумма повышения температур у трех кроликов меньше или равна 1,4^oC Σ≤ + 1,4^oC. Если эта сумма превышает 2,2^oC Σ> + 2,2^oC, то бактериофаг считали пирогенным.

Предлагаемый способ позволяет провести депирогенизацию практически всех видов бактериофагов, а контактирование детергентов или комплексообразователей с бактериофагами не приводило к разрушению или потере литической активности фаговых частиц или нарушению стабильности бактериофагов во время хранения. Приведенная совокупность отличительных признаков способа в данной комбинации в литературе не описана, а их влияние на достижение технического результата не следует из известного уровня техники. Предложенное техническое решение обеспечивает достижение технического результата и может быть реализовано в технологии получения бактериофагов.

Способ осуществляют следующим образом. Фаголизат подвергают микрофильтрации через мембраны 0,2 мкм для удаления детрита и клеток. В осветленный фаголизат вводят комплексообразователь до концентрации 0,002 - 0,01 М, либо детергент - до 05 - 1,0% и концентрируют ультрафильтрацией, например, на плоскокамерном аппарате с мембранами с порогом задержания по мол.массе 200 - 300 КДа, затем проводят диафильтрацию против 0,002 - 0,03 М раствора комплексообразователя или 0,05 - 1,0% детергента со сменой трех объемов и удаляют из препарата бактериофага введенные компоненты диафильтрацией 3 - 5 объемами физиологически приемлемого буфера типа изотонического 0,85% раствора натрия хлорида, фосфатного или трис-буфера. Затем проводят заключительную стерилизующую фильтрацию.

Пример 1. Фаголизат дизентерийного бактериофага Зонне S₁ фильтруют через фильтр-картон, затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк в тангенциальном потоке. Профильтрованный фаголизат 10 л не содержит бактериальных клеток, концентрация фага составляет 7•10¹⁰ фаг. част./мл; концентрация белка - 1900 мкг/мл, в результате на единицу активности (фаговую частицу) - 271,4•1-^-10 мкг/фаг. част. Введение фага трем кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +1,2; +1,4; +1,5^oC Σ± 4,1^oC. В фаголизат для устранения пирогена добавляют ЭДТА до концентрации 2 мМ и концентрируют ультрафильтрацией в 10 раз по объему через мембраны УПМ-200, 200000 Да, (ПО "Тасма", Казань) в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного апирогенного 0,15 М раствора NaCl, содержащего 2 мМ ЭДТА. Далее удаляют ЭДТА диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 3 объемов 0,15 М раствора NaCl. Полученный диафильтрат разводят до исходного объема (10 л) 0,15 М раствором NaCl. Полученный диафильтрат содержит 7•10¹⁰ фаг.част./мл (выход 100%); концентрация белка - 6 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 0,86•10^-10 мкг/фаг. част.; степень очистки - 99,95%. Препарат апирогенен: введение фага трем кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +0,2; +0,3; +0,3^oC Σ± 0,8^oC). Очищенный по известному способу препарат оказался пирогенным: +1,0; +1,1; +1,2^oC Σ± 3,3^oC.

Пример 2. Фаголизат бактериофага Staphylococcus aureus фильтруют через фильтр-картон. Затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк в тангенциальном потоке. Профильтрованный фаголизат 10 л не содержит бактериальных клеток, концентрация фага составляет 3•10⁹ фаг.част./мл; концентрация белка 10000 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 33333•10^-10 мкг/фаг. част. Введение фага кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +2,0; +2,0; +2,0^oC Σ± . В профильтрованный фаголизат добавляют ЭДТУК до концентрации 10 мМ и концентрируют ультрафильтрацией в 5 раз по объему через полисульфоновые мембраны 30000 Да (Sartorlus AG, Germany) в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного 0,15 М раствора трис-буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК. Далее удаляют ЭДТУК диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 5 объемов 0,15 М NaCl. Полученный диафильтрат разводят до исходного объема (10 л) диафильтрующим раствором. Полученный диафильтрат содержит 3•10⁹ фаг.част./мл (выход 100%); концентрация белка 80,0 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 266,7\10^-10 мкг/фаг.част.; степень очистки - 99,2^oC. Препарат апирогенен: введение фага трем кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +0,1; +0,2; +0,2^oC (Σ +0,5^oC). Очищенный по известному способу препарат пирогенен: +1,7; +1,8+1,8^oC Σ± 5,3^oC.

Пример 3. Фаголизат бактериофага Streptococcus enterococcus фильтруют через фильтр-картон. Затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк с тангенциальном потоке. Профильтрованный фаголизат 10 л не содержит бактериальных клеток, концентрация фага составляет 2,9•10⁷ фаг.част./мл; концентрация белка 6000 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 206.89•10^-6 мкг/фаг. част. Введение фага трем кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +1,8; +1,9+1,9^oC Σ± 5.5^oC). В профильтрованный фаголизат добавляют ЭДТУК до концентрации 0,03 М и концентрируют ультрафильтрацией в 10 раз по объему через полисульфоновые мембраны РТМК 300000 Да (Mllllpore, USA) в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного раствора, содержащего 0,14 М NaCl, 0,003 М LH₂ PO₄, 0,007 M Na₂HPO₄, 0,03 М ЭДТУК. Далее комплексообразователь удаляют диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 5 объемов диафильтрующего раствора без ЭДТУК. Полученный диафильтрат разводят до исходного объема (10 л) диафильтрующим раствором. Полученный диафильтрат содержит 2,9•10⁷ фаг. част./мл (выход 100%); концентрация белка 27 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 0,93•10^-6 мкг/мл/фаг. част. ; степень очистки - 99,55%. Препарат апирогенен: введение фага трем кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +0,0; +0,1; +0,2^oC ( Σ 0,3^oC). Очищенный по известному способу препарат пирогенен: +1,5; +1,6+1,6^oC ( Σ± 4,7^oC).

Пример 4. Фаголизат синегнойного бактериофага Pseudomonas aeruglnosa фильтруют через фильтр-картон. Затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк с тангенциальном потоке. Профильтрованный фаголизат 10 л не содержит бактериальных клеток, концентрация фага составляет 5•10⁶ фаг.част/мл; концентрация белка 8500 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 1700•10^-6 мкг/фаг.част. Введение трем кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +1,7; +1,7; +1,9^oC ( Σ 5,3^oC). В профильтрованный фаголизат добавляют твин 80 до концентрации 0,1% и концентрируют ультрафильтрацией в 10 раз по объему через поливинилидендифторидные мембраны PZHK 200000 Да (Mllllpore, USA) в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного апирогенного 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,1% твина 80. Далее удаляют детергент диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 3 объемов 0,15 М раствора NaCl. Полученный диафильтрат разводят до исходного объема (10 л) диафильтрующим раствором. Полученный диафильтрат содержит 5•10^-6 фаг.част./мл (выход 100%); концентрация белка 59,5 мкг/мл, а расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 11,9•10^-6 мкг/фаг.част.; степень очистки - 99,3%. Препарат апирогенен: введение фага 3 кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +0,3; +0,3; +0,4^oC ( Σ± 1,0^oC). Очищенный по известному способу препарат оказался пирогенным: +1,3; +1,4; +1,4^oC ( Σ± 4,1^oC).

Пример 5. Фаголизат протейного бактериофага Proteus vulgarls фильтруют через фильтр-картон. Затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк в тангенциальном потоке. Профильтрованный фаголизат 10 л не содержит бактериальных клеток, концентрация фага составляет 4•10⁶ фаг.част./мл; концентрация белка 7200 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 1800•10^-6мкг/фаг. част. Введение фага кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +1,4; +1,4; +1,5^oC ( Σ± 4,3^oC). В профильтрованный фаголизат добавляют твин 20 до концентрации 1% и концентрируют ультрафильтрацией в 10 раз по объему через поливинилидендифторидные мембраны PZHK 200000 Да (Mllllpore, USA) в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного апирогенного 0,15 М раствора NaCl, содержащего 1% твин 20. Далее удаляют детергент диафильтрацией в постоянном объеме сменой 5 объемов 0,15 М раствора NaCl. Полученный диафильтрат разводят до исходного объема (10 л) диафильтрующим раствором. Полученный диафильтрат содержит 4•10⁶ фаг.част./мл (выход 100%); концентрация белка 68,4 мкг/мл, в расчете на единицу активности (фаговую частицу) - 17,1•10^-6 мкг/фаг.част.; степень очитки - 99,5;. Препарат апирогенен: введение фага трем кроликам в дозе 1 мл/кг массы тела вызывало повышение температуры на +0,2; +0,3; +0,3^oC ( Σ± 0,8^oC). Очищенный по известному способу препарат оказался пирогенным: +1,0; +1,1; +1,2^oC ( Σ± 3,3^oC).

Внедрение препаратов бактериофагов пригодных для парентерального применения позволит практическому здравоохранению расширить показания к применению и повысить эффективность препарата.

Использованные литературные источники
1. Регламент производства пиобактериофага комбинированного жидкого N 242-82. Тбилисский НИИВС.

2. Патент РФ N 2036232, кл. C 12 N 7/00. Способ получения пиобактериофага.

3. ФС: Бактериофаг стафилококковый жидкий 42-3236-95. Бактериофаг стрептококковый жидкий 42-3243-95. Бактериофаг Pseudomonas aeruglnosa (синегнойный) жидкий 42-3239-95. Бактериофаг сальмонеллезных групп ABCDE жидкий и сухой с кислотоустойчивым покрытием 42-16BC-86. Бактериофаг дизентерийный поливалентный жидкий ВФС 42-2460-95.

4. Патент РФ N 1412302, кл. C 12 N 7/00, 1983. Способ выделения бактериофагов.

5. Чанишвили Т.Г., Ц.В.Георгадзе, Т.Г.Чиракадзе, Н.К.Чхенкели. Опыт получения лечебного ареактивного препарата стафилофага на ПСС для внутривенного введения и изучение продукции экзотоксинов стафилококка в процессе фаголизиса. Материалы юбилейного симпозиума, посвященного 50-летию Тбилисского НИИВС. Теоретические и практические вопросы бактериофагии, Тбилиси, 1974, 263 - 265.

6. Государственная фармакопея СССР, 11 издание, вып. 2, с. 184.

Способ может быть использован при получении лечебно-профилактических бактериофагов, предназначенных для парантерального и внутривенного введения. Фаголизат подвергают микрофильтрации через мембраны для удаления детрита и клеток. В осветительный фаголизат вводят комплексообразователь или детергент. Концентрируют фаголизат ультрафильтрацией через мембраны с порогом задержания 200 - 300 КДа. Затем проводят диафильтрацию против раствора комплексообразователя или детергента со сменой трех объемов физиологически приемлемого буфера. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ выделения бактериофагов микрофильтрацией с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией, отличающийся тем, что ультрафильтрацию проводят на мембранах с порогом задержания 200 - 300 КДа в присутствии комплексообразователей или детергентов с последующей диафильтрацией физиологически приемлемым буфером. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве комплексообразователей используют ЭДТА и ЭДТУК в концентрации 0,002 - 0,03 М. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве детергентов используют твин 80, или твин 20, или тритон Х-100 в концентрации 0,05 - 1,0%.