СПОСОБ ОЧИСТКИ ИММУНОГЛОБУЛИНА ОТ ПИРОГЕННЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и может быть использовано для очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ.

В настоящее время в связи с отказом от использования асбеста используется множество методов удаления пирогенов. Но количество и возможности резко ограничиваются для белков в связи с их высокой вязкостью, наличием различных связей между молекулами белка и липополисахаридов (пирогенов) : гидрофобных, ионных, водородных.

Часто изоэлектрические точки белков и липополисахаридов близки, а если нет, то возможны и более сильные взаимодействия типа антигена (липополисахарид) - антитела (иммуноглобулин). Кроме того, при депирогенизации возможна и денатурация интересуемого продукта.

Обработка щелочью, кислотой, хлороформом и другими химическими реагентами не приемлема для иммуноглобулина в связи с потерями эффекторных функций иммуноглобулина - снижение титра антител, полимеризации. В литературе пока не описана возможность удаления пирогенов из иммуноглобулина ультрафильтрацией в связи с близостью молекулярных весов.

Не получили распространения в мире и другие методы из-за отсутствия воспроизводимости и неэффективности. Обработка активированным углем [1] не дала положительных результатов, так как не только гидрофобные связи участвуют в связывании липополисахаридов.

Ионообменная хроматография [2] также не дает постоянных положительных результатов из-за использования только ионных связей. Кроме того, хроматографический материал может деградироваться и оказаться в препарате. Часто сорбенты сами могут стать источниками процесса хроматографии.

Использование детергентов [3] часто приводит к денатурации самого иммуноглобулина, снижает его выход при осаждении этанолом, так как увеличивает его растворимость. Существует возможность элюции пирогенов детергентами с оборудования и материалов, с которыми контактирует белок.

Афинный способ [4] не гарантирует от попадания лиганда, сшивающего агента, сорбента в препарат.

Наиболее близким аналогом является метод обработки гидроокисью алюминия. Однократность использования, возможность стерилизации и обработки гидроокиси алюминия при 180^oC в течение 3 ч (гарантирует депирогенизацию). Легкость удаления, отсутствие разбавления, сохранность нативного состояния интересуемого продукта. Все это предопределило выбор в пользу гидроокиси алюминия.

Известен способ очистки иммуноглобулина от пирогенных субстанций согласно источнику [5]. Удаление пирогена гидроокисью алюминия проводится при следующих условиях: количество Al(OH)₃ - 3,0 - 5,0 г на 1000 мл иммуноглобулина, величина pH 6,6 - 7,4, концентрация белка 9,5 - 10,5 % и общей молярности раствора 0,45 М, за счет 2,25 % (0,3 М) раствора гликокола и 0,9 % (0,15 М) раствора натрия хлорида. Обработка проводится в течение трех суток с последующей фильтрацией через мезгу и осветляющей фильтрацией.

Недостатками этого способа являются низкая эффективность снятия пирогенности (процент снятия пирогенности составляет 40 ± 8,94; n - 30), длительность обработки - 3 суток (72 ч).

Задачей, решаемой изобретением, является увеличение эффективности снятия пирогенности иммуноглобулина.

Технический результат: повышение выхода депирогенизированного иммуноглобулина (процент депирогенизации возрос с 40 ± 8,94 до 90 ± 5,48; выход с 36,22 ± 5,80 до 89,80 ± 7,10 %, n = 60) и сокращение длительности процесса с 72 до 4 - 6 ч.

Общим для прототипа и заявляемого изобретения является сорбент - гидроокись алюминия.

Отличительные признаки приведены в табл. 1.

Нами установлено, что для увеличения сорбции пирогенных субстанций на гидроокиси алюминия необходимо снизить концентрацию белка, ионную силу и величину pH.

Понижение pH и ионной силы, уменьшение концентрации белка приводит к снижению вязкости раствора, общей величины заряда липополисахаридов пирогена (растворимости), межбелковых взаимодействий, увеличению взаимодействия между гидроокисью алюминия и липополисахаридами, следовательно, к более полному удалению сорбентом пирогенов из раствора иммуноглобулина. Это позволило провести депирогенизацию практически всех серий иммуноглобулина. Процесс занимает вместо 72 всего 4 - 6 ч, увеличивается выход апирогенного иммуноглобулина более чем в 2 раза, а короткое время контакта сорбента с белком при комнатной температуре не приводило к ухудшению других показателей: ни молекулярных параметров, ни титров нормальных антител. В отличие от этого регламентный способ приводил к фрагментации и полимеризации иммуноглобулина, снижению титра специфических антител на порядок. Приведенная совокупность отличительных признаков заявленного способа в литературе не описана, а их влияние на достижение технического результата не следует из известного уровня техники. Предложенное техническое решение обеспечивает достижение технического результата и может быть реализовано в технологи получения иммуноглобулинов.

В процессе выбора параметров были определены следующие оптимальные точки:
pH в интервале 4,5 - 6,3. Превышение pH не снимало пирогенности, снижение pH приводило к большему растворению гидроокиси алюминия и затруднению отбивания осадка, трудностям стерилизующей фильтрации и мутности препарата;
ионная сила должна быть в пределах 0,05 - 0,15 М, увеличение ионной силы выше 0,15 М не снимало пирогена, а снижение ниже 0,05 М увеличивало растворимость гидроокиси алюминия с плохим отбиванием осадка гидроокиси и соответственно также не снимало пирогенности;
процент белка должен быть в диапазоне 1,0 - 5,0 %. При более высокой концентрации белка увеличиваются вязкость (плохо отбивается гидроокись), межбелковые взаимодействия, соответственно не снимается пирогенность. Снижение концентрации белка ниже 1 % приводит к увеличению обрабатываемых объемов, денатурации белка и уменьшению выхода.

Для достижения технического результата осуществляется следующий технологический процесс. В растворе пирогенного иммуноглобулина 0,1 - 0,3 М раствором соляной кислоты устанавливают pH 4,5 - 6,3 и разбавляют дистиллированной водой в 2 - 10 раз до концентрации белка от 1,0 до 5,0 %. Необходимой ионной силы добиваются либо простым разбавлением дистиллированной водой для инъекции либо диафильтрацией для достижения молярности 0,05 - 0,15 М. Добавляют гидроокись алюминия в количестве 3 - 5 г/1000 мл иммуноглобулина. Раствор осторожно перемешивают встряхиванием в течение 1,0 - 2,0 ч, выстаивают в течение 30 мин. Центрифугируют при 2000 - 3000 об/мин на центрифуге РС-6 или подвергают осветляющей фильтрации через осветляющие мембраны и концентрируют до 12,0 - 13,0 % белка ультрафильтрацией. Устанавливают необходимые показатели: pH, ионную силу добавлением недостающих количеств глицина и натрия хлорида и концентрацию белка 9,5 - 10,5 %.

В табл. 2 представлены результаты, полученные в результате депирогенизации заявляемым способом и регламентным. Выход апирогенного иммуноглобулина составляет 89,80 ± 7,10 %. Процент депирогенизации составляет 90 ± 5,48, время обработки 4 - 6 ч. В то время как процент депирогенизированных серий по известному способу составил лишь 40 ± 5,48, и время, необходимое для обработки, 72 ч, при выходе 36,22 ± 5,8. Следовательно, различия в выходе можно считать статистически значимыми.

Пирогенность или апирогенность иммуноглобулина оценивалась согласно источнику [6]:
раствор лекарственного средства считается непирогенным, если сумма повышения температур у трех кроликов меньше или равна 1,4^oC.

Если эта сумма превышает 2,2^oC, то раствор лекарственного считается пирогенным.

Пример 1. 1000 мл 10 %-ного пирогенного иммуноглобулина (+0,9+0,9+1,0; Σ = 2,8)^oC осторожно подкисляют 0,2 М раствором соляной кислоты до pH 4,9. Разбавляют дистиллированной водой для инъекций до 3300 мл (до 3,0 % белка) и ионной силы 0,15 М. Добавляют 4 г гидроокиси алюминия и осторожно перемешивают 1,5 ч, отстаивают 30 мин. Центрифугируют при 2500 об/мин 30 мин на центрифуге РС-6. Концентрируют на ВПУ-15 (0,2 м²) до 12,0 - 13,0 % белка. Осторожно подщелачивают 0,25 М раствором NaOH до pH 7,0. Доводят содержание белка, хлорида натрия, глицина до 10,0; 0,9 и 2,25 % соответственно. Полученный объем иммуноглобулина составляет 920 мл. Выход 97 %. Температурные параметры (+0,2; +0,2; +0,3; Σ = 0,7)^oC.

Пример 2. 1000 мл 10 %-ного пирогенного иммуноглобулина (+0,9 + 1,0 + 1,0; Σ = 2,9)^oC осторожно подкисляют 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 4,5. Доводят дистиллированной водой для инъекций до 10000 мл (до 1 % белка) и ионной силы 0,05 М. Прибавляют сухой гидроокиси алюминия в количестве 4 г, перемешивают 1 ч, отстаивают 30 мин. Дальнейшие операции выполняются согласно примеру 1. Выход 90 %, температурные характеристики (+0,2; +0,3; +0,3; Σ = 0,8)^oC.

Пример 3. В 1000 мл 10 %-ного пирогенного иммуноглобулина (согласно примеру 1) устанавливают pH 6,3 0,3 М соляной кислотой. Доводят до 2000 мл дистиллированной водой для инъекций (5 % белка). Проводят диафильтрацию на ВПУ-15 (0,2 м²) 3 объемами 0,1 М раствора хлорида натрия для перевода в раствор с ионной силой 0,1 М. Все последующие операции проводят согласно примеру 1. Выход 83 %, температурные данные (+0,3; +0,3; +0,3; Σ = 0,9)^oC.

Список литературы:
1. A 61 K 39/395 Патент Франции N 2 433 342, 14.3.1980.

2. A 61 K 39/395 Патент EP N 0 085 747, 14.05.86.

3. A 61 K 35/16 Патент EP N 0 050 061, 11.12.85.

4. Sharma S. K. Endotoxin detection and elimination in Biotechnol. and appl. Biochem, 1986, 8, N 1, 5 - 22.

5. Регламент производства "Иммуноглобулина человека нормального" N 131-79, утвержденный 3 мая 1986 г.

6. Государственная фармакопея СССР, 11 изд. вып. 2, с. 184.

Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ включает доведение раствора пирогенного иммуноглобулина до рН 4,5-6,3, разбавление дистиллированной водой до концентрации белка 1,0-5,0% и ионной силы 0,05-0,15 М, отделение образовавшегося осадка и концентрирование раствора до необходимой концентрации белка. 2 табл.

Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ, включающий обработку сорбентом гидроокиси алюминия с последующим удалением осадка, отличающийся тем, что перед добавлением гидроокиси алюминия в растворе пирогенного иммуноглобулина устанавливают pH 4,5 - 6,3, затем разбавляют дистиллированной водой до концентрации белка 1,0 - 5,0% и ионной силы 0,05 - 0,15 М, после отделения осадка проводят концентрирование раствора до необходимой концентрации белка.