КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖЕЛЕЗА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицинской диагностике, а именно к определению содержания железа в сыворотке крови человека.

Количественное определение железа в сыворотки крови является одним из основных клинических лабораторных тестов при выявлении нарушений метаболизма железа в организме человека, в том числе различных форм анемии, гемоглобинопатий, гемосидерозов и гемохроматозов.

Почти все железо сыворотки крови связано с транспортным белком гликопротеидом трансферрином (в форме Fee(III) комплекса), а также, в меньшей степени, с другими белками и свободными аминокислотами.

Международный комитет стандартизации в гематологии (ICSH) в качестве референтного рекомендует метод определения сывороточного железа в крови человека [1, 2], включающий:
а) освобождение железа из железосвязывающих белков сыворотки в кислой среде и восстановление его в двухвалентное;
б) осаждение белков сыворотки и удаление их с помощью центрифугирования;
в) взаимодействие ионов железа (II) с батофенантролином или другими селективными лигандами (хромогенами) и измерение оптиической плотности образовавшихся окрашенных комплексов.

Недостатком референтного метода является необходимость осаждения белков (депротеинизации) сыворотки, что усложняет проведение анализа и делает его малопригодным для использования в автоматических анализаторах.

В то же время описаны так называемые "прямые" способы определения железа в сыворотке, в которых исключается депротеинизация, при этом композиция рабочего раствора подобрана таким образом, чтобы освобождение железа из железосвязывающих белков и его взаимодействие с хромогеном происходит в присутствии сывороточных белков, в условиях, при которых последние не преципитируют и не оказывают влияния на определение оптической плотности [3-13]. Предлагаемая композиция предназначена для использования как раз в таких "прямых" способах.

В течение длительного времени в клинической биохимии для определения железа в качестве хромогена использовался батофенантролин, но в настоящее время показано, что феррозин и ферен являются более чувствительными, что позволяет уменьшить объем образца сыворотки. Оптические плотности их комплексов с железом (II) максимальны между pH 3 и 6 и окрашенные комплексы стабильны вплоть до 3 час. Оптимальными условиями опыта являются pH 4,5 с концентрацией ацетата Na 1,5 М и 0,025% концентрацией хромогена [2]. Феррозин и ферен не обладают достаточной специфичностью, они способны образовывать окрашенные комплексы и с медью. В случаях повышенного содержания меди определенное количество железа примерно на 10% выше истинного. Интерференцирующее влияние меди может быть устранено добавлением соответствующих реагентов. Неокупраин, тиосемикарбазид и тиомочевина образуют устойчивые комплексы с медью, исключая ее взаимодействие с хромогеном.

Требования, предъявляемые к композиции, противоречивы. С одной стороны, для правильности анализа необходимо полное извлечение железа из сывороточных белков, что возможно при низких (1,5-2,0) значениях pH. С другой стороны, белки сыворотки в сильнокислой среде подвергаются денатурации и выпадают в осадок, что препятствует определению оптической плотности. Необходимо учитывать также оптимальный диапазон pH работы хромогена - около 4,5, а также то, что исходная сыворотка может быть мутной (липемической), что часто встречается у гемохроматозных больных. Желательно также, чтобы получаемый раствор был стабилен в течение длительного времени.

В большинстве "прямых" способов для предотвращения осаждения белков используются поверхностно-активные вещества - Twin-20, Teepol, Triton X-100, Brij-35 и другие, а в качестве восстановителя - аскорбиновая кислота, гидроксиламин, тиогликолевая кислота, дитионит натрия.

Аналогом предлагаемой композиции может быть состав раствора, описанного Denney & Outcalt [8], и содержащего 0,3% Triton X-100, 0,5% Brij-35 и 10% диметилсульфоксида. В качестве восстановителя авторы использовали 25% водный раствор аскорбиновой кислоты.

Прототипом предлагаемой композиции может быть состав реагента для освобождения железа из белков, описанный Jonson & Williams Clin. Chim. Acta, 1990, v 189, N 2, p. 194-204, и содержащий 0,5% Twin-20, 0,5% тиомочевины, 0,1% аскорбиновой кислоты в 0,1 М соляной кислоты. Этот реагент стабилен 4-5 дней при хранении в холодильнике. Определение сывороточного железа по этому способу включает в себя обработку образца сыворотки реагентом, при которой происходит извлечение железа и его восстановление, добавление хромогена (батофенантролина) и ацетатном буфере (для создания оптимального pH образования комплекса) и, после небольшой инкубации, определение оптической плотности с учетом холостой пробы на реактивы и холостой пробы на сыворотку.

Мы предлагаем композицию для определения сывороточного железа, включающую в себя:
- мочевину в концентрации 200-600 г/л;
- неионный детергент в концентрации 1,0-10 г/л (в качестве неионного детергента могут быть использованы различные полиоксиэтиленовые эфиры, такие как Twin-20, Twin-40; Triton X-100, Brij-35, Nonidet P40, Sterox SE и другие);
- восстановитель в концентрации 10-100 г/л (например гидроксиламин гидрохлорид);
- тиомочевину 0-10 г/л;
- соляную кислоту 0-0,5 моль/л;
- pH получаемого водного раствора должен находиться в пределах 1,50-1,80.

Определение сывороточного железа с использованием предлагаемой композиции осуществляется следующим образом: к образцу сыворотки прибавляют рабочий раствор, состав которого и является предлагаемой композицией, и после выдержки для извлечения железа из белков сыворотки и его восстановления pH раствора доводится до значения 4,5 добавлением ацетатного буфера, после добавления хромогена, в качестве которого могут быть использованы феррозин или ферен, проводится определение оптической плотности с учетом холостой пробы на реактивы и холостой пробы на сыворотку.

Применение концентрированного раствора мочевины (хаотропного агента) в сочетании с неионным детергентом позволяет получать необходимые для колориметрического определения прозрачные растворы даже с мутными, липемическими сыворотками, без применения органических растворителей. Наличие детергентов и низкое значение pH реакционной смеси позволяет полностью извлекать железо из железосвязывающих белков во всем диапазоне его содержания в сыворотке, как в норме, так и для различных патологических состояний.

Тиомочевина включает в композицию для исключения влияния меди, содержащейся в сыворотке.

Пример 1. Композицию готовили путем смешивания следующих ингредиентов, г: мочевина - 480; тиомочевина - 5; Tween-20 - 3; соляная кислота концентрированная - 30 мл; гидроксиламин гидрохлорид - 50; бидистиллированная вода - до 1 л, pH получаемого раствора 1,66.

Полученная композиция устойчивая при хранении при 2-8^oC в течение трех месяцев.

Пример 2. К 0,5 мл липемической сыворотки больного добавляли 2,5 мл раствора по примеру 1, перемешивали, инкубировали 20 минут при комнатной температуре, добавляли 0,5 мл 3 М ацетата натрия, перемешивали и определяли оптическую плотность A1 против холостой пробы, содержащей вместо сыворотки 0,5 мл бидистиллированной воды. Затем приливали 0,02 мл 30 г/л раствора феррозина, перемешивали и через 10-15 минут определяли оптическую плотность A2 против холостой пробы.

Аналогично получали оптические плотности A3 и A4 для раствора сравнения, в котором вместо 0,5 мл сыворотки использовали 0,5 мл стандартного раствора железа с концентрацией 200 мкг/100 мл (35,8 мкмоль/л). Количество железа в сыворотке составляло:
.

Пример 3. Аналогично примеру 2 определяли количество железа в сыворотке здорового человека и получили:
.

Литература
1. International Committee for Standardization in Haematology // British J. of Haematology, 1978, - v 38, - p. 291-294.

2. International Committee for Standardization in Haematology // British J. of Haematology, 1990, - v 75, - p. 615-616.

3. М.Г.Творогова, В.Н.Титов // Лабораторное дело, 1991, - N 9, - с. 4-10.

4. Лукичева Т.И., Прудник И.М. // Лабораторное дело, 1983, - N 5, - с. 24-29.

5. Чевари С., Андял Т. // Лабораторное дело, 1987, N 4, с. 252-255.

6. Ceriotti F.A.R. // U.S. Pat. 4,308,027; 29.12.1981, Int. Cl/³-G 01 N 33/52, U.S. C1. - 436-74.

7. Johnson D.J., Williams H.L. // Clin. Chim. Acta. - 1990, v. 189. - N 2. - p. 194-204.

8. Denney J.W., Outcalt M.C. // U.S. Pat. 4, 224, 034; 23.09.1980, Int. C1.² - G 01 N 33/16, U.S. C1. - 23/230B.

9. Torelly G. // U. S. Pat. 4,801,656; 07.03.1989, Int. C1. - G 01 N 33/20, U.S. C1⁴. - 436-74.

10. Tabacco A., Tarli P. // U.S. Pat. 4,407,962; 40.10.1983, Int. C1/³ - G 01 N 33/48, U.S. C1. - 436-74.

11. Williams H.L. // J. Lab. Clin. Med. - 1966, - N 1. - p. 171-176.

12. Giuliani F., DeLuca U., D'Eril G.V.M., Moratti R. // Haematologica. - 1985. - v. 70. - N 1. - p. 6-10.

13. Tabacco A. , Moda E., Tarli P. // U.S. Pat. 4,703,015; 27.10.1987, Int. C1.⁴ - G 01 N 33/48, U.S. C1. - 436-74.

Предлагается композиция для колориметрического определения железа в сыворотке крови при клинической диагностике нарушений метаболизма железа в организме человека. Композиция представляет собой водный раствор, содержащий мочевину, неионный детергент, восстановитель, тиомочевину и соляную кислоту и имеет рН 1,50 - 1,80. Определение осуществляется следующим образом: к образцу сыворотки прибавляют рабочий раствор, состав которого и является предлагаемой композицией, и после выдержки для извлечения железа из белков сыворотки и его восстановления рН раствора доводится до значения 4,5 добавлением ацетатного буфера, после добавления хромогена (например, феррозина) проводится определение оптической плотности. Использование композиции позволяет определять сывороточное железо в патологических, мутных и липемических сыворотках без их депротеинизации.

Композиция для колориметрического определения железа в сыворотке крови, представляющая собой водный раствор, содержащий неионный детергент, тиомочевину, восстановитель и соляную кислоту, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит мочевину, а в качестве восстановителя - гидрохлорид гидроксиламина при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Неионный детергент - 1 - 10
Тиомочевина - Не более 10
Гидрохлорид гидроксиламина - 10 - 100
Соляная кислота, моль/л - Не более 0,5
Мочевина - 200 - 600
Бидистиллированная вода - До 1 л
при этом рН композиции 1,5 - 1,8.