СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ КИЛЛЕРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРБАРИИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области водолазной медицины и физиологии подводных погружений и может быть использовано для определения влияния факторов гипербарии (величины общего давления, вида используемой газовой смеси, типа водолазного спуска, параметров микроклимата в гипербарических комплексах и т.д.) на естественную киллерную активность лимфоцитов крови водолазов.

Большинство существующих аналогов изучения феномена естественной киллерной активности лимфоцитов построены по принципу регистрации повышения проницаемости мембраны клетки-мишени. Регистрация эффекта проницаемости и последующего выхода части продуктов белкового или нуклеинового обмена с использованием радиоактивных меток способствовало внедрению целой серии цитотоксических тестов. Из существующих прототипов, основанных на использовании радиоактивной метки, был применен способ оценки функциональной активности естественных киллеров в ³H-уридиновом цитотоксическом тесте (Рыкова М.П. и др. Новая высокочувствительная техника тестирования нормальных киллеров. Иммунология, 1981, т. 1, с. 88-90). В отличие от данного прототипа, использующего и "быстрый", и "медленный" варианты указанного теста, в предложении используется только тест с длительной инкубацией смеси клетки-эффекторы : клетки-мишени. Обусловлено это существенной вариацией данных при различных соотношениях эффекторы:мишени (Э:М) в тесте с 4-часовой длительностью периода инкубации.

С целью повышения точности интерпретации и оценки функциональной активности естественных киллеров при пребывании организма в условиях гипербарии изобретение включает цитофлоуриметрический прототип цитотоксического теста (Shi et al. The application of flow cytometry in the study of natural killer cell cytotoxicity. Clinical Immunology and Immunopathology. - 1987, vol. 45, p. 356-365. ), отличающийся тем, что используется "ламповый" тип проточного цитометра. Ввиду установления на подобном типе оборудования 100 Вт ртутной лампы, работа которой характеризуется большей нестабильностью определенных величин по сравнению с лазерными источниками светового возбуждения, дополнительно в обязательном порядке включает этап оптимизации параметров прибора.

Сущностью цитофлуориметрического анализа является последовательный подсчет смеси Э: М в контрольных и опытных пробах с применением флуорохромов, которые соответственно окрашивают инкубируемые клетки с интактной мембраной (т.е. "живые" клетки) или с поврежденной мембраной ("погибшие" клетки). Разницу в количестве последних рассчитывают и определяют как цитотоксический эффект. В существующих цитофлуориметрических аналогах исследования киллерной функции лимфоцитов период инкубации смеси клеток в различных соотношениях Э: М составляет 4 ч.

Предлагаемый способ анализа естественной киллерной активности лимфоцитов человека при пребывании в условиях гипербарии в отличие от прототипов, используемых для нормальных условий, основан на том, что для исследования данного компонента иммунного статуса организма в указанных условиях пробы крови декомпрессируют по режиму, исключающему влияние данного этапа на анализируемый показатель.

Таким образом, прототипом и базовым объектом предлагаемого изобретения является способ определения естественной киллерной активности лимфоцитов человека, пребывающего в условиях повышенного давления газовой среды. Сущность предлагаемого способа состоит в проведении параллельных цитотоксических тестов, различающихся по методу проведения анализа и периода инкубации, после соответствующего режима декомпрессии проб периферической крови, полученных в условиях гипербарии.

Последовательность этапов осуществляют следующим образом.

I. Забор и получение проб крови организма человека из условий повышенного давления.

Забор крови испытуемых, находящихся в гипербарических условиях в барокамере, производят утром натощак из кубитальной вены пункцией в стерильные стеклянные пробирки с гепарином в качестве антикоагулянта, после чего помещают в специальный контейнер в лед на период времени декомпресии.

Режим декомпрессии составляют следующим образом:
1. Декомпрессию проводят линейно с постоянной скоростью 4 м в 1 мин;
2. С целью поддержания выбранного оптимального диапазона величины pО₂ от 0,3 до 0,4 атм в период декомпрессии подают расчетное количество кислорода в соответствии с предлагаемым графиком:
в диапазоне глубин от 400 м (41 ата) до 150 м (16 ата) - подача O₂ через каждые 50 м;
в диапазоне от 150 м (16 ата) до 100 м (11 ата) - подача O₂ через каждые 25 м;
в диапазоне от 100 м (11 ата) до 20 м (3 ата) - подача O₂ через каждые 10 м;
в диапазоне от 20 м (3 ата) до 0 м (1 ата) - подача O₂ через каждые 5 м.

Расчет потребного количества кислорода на всех этапах его подачи производят по следующей формуле:
Q = (P₁-P₂)•C•V/100
где
P₁ - давление в барокамере на предшествующем этапе подачи кислорода (ата);
P₂ - давление в барокамере на последующем этапе подачи кислорода (ата);
C - содержание кислорода в газовой смеси (получают на основании результатов газового контроля или расчетным путем из суммирования объема кислорода воздуха в исходных условиях и кислорода в поданной газовой смеси на компрессии по отношению ко всему объему полученной газовой смеси на "грунте" и в дальнейшем на этапах декомпрессии).

V - объем гипербарокамеры, л.

По окончании декомпрессии пробы периферической крови подвергают процедуре выделения лимфоидных клеток, проведения параллельных радиометрического и цитофлуориметрического тестов исследования естественной киллерной активности.

II. Получение взвеси лимфоцитов периферической крови человека.

Лимфоциты получали из проб крови путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, США) при 700g в течение 30 мин. Клетки дважды отмывали в среде RPMI-1640 (Flow, Англия) при 400g в течение 25 мин. Для удаления прилипающих клеток используют инкубацию клеток при 37^oC в течение 1 ч. на пластиковых чашках Петри диаметром 40 мм ("Медполимер", Россия) в полной среде RPMI-1640 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 20 мМ HEPES (Sigma, США), 80 мкг/мл гентамицина (Pharmachim, Болгария), 5 мкг/мл PHK-азы (Reanal, Венгрия). Взвесь полученных лимфоцитов после подсчета в гемоцитометрической камере разделяют для радиометрического и цитофлуорометрического тестов.

III. Радиометрическое определение цитотоксической активности лимфоцитов крови (³H-уридновый цитотоксический тест)
Для определения цитотоксической активности естественных киллеров (ЕК) крови человека применяют прототип Рыковой и соавт. (1981). В качестве клеток-мишеней используют культуру клеток K-562 эритробластоза человека, меченных ³H-уридином (35-40 БК на 10⁶ клеток). Цитотоксический тест проводят в полной среде RPMI-1640. Соотношение эффекторов-лимфоцитов и клеток-мишеней (Э:М) устанавливают в следующем отношении: 50:1, 25:1, 10:1 и 5:1. После 18 ч инкубации при 37^oC в атмосфере с 5% CO₂ учитывают уровень активности ЕК радиометрическим методом с помощью сцинтилляционного счетчика Beckman (США). Цитотоксическую активность ЕК характеризуют цитотоксическим индексом (ЦИ), рассчитываемым по формуле: ЦИ=100(X_O-X_K)/X_K, где X_O и X_K - радиоактивность опытной и контрольной проб соответственно. Для каждого соотношения в каждой пробе делают триплетное измерение, после чего вычисляют среднюю и среднеквадратическое отклонение.

IV. Цитофлуориметрический тест (ЦФТ) определения естественной киллерной активности лимфоцитов крови.

Для анализа используют цитометр ACR-1500 (Bruker Spectrospin, Франция) в стандартной комплектации блоков оптических фильтров, чем устанавливается спектр возбуждающего света в диапазоне 470-490 нм. Регистрацию флуоресценции производят в диапазоне 540 ± 20 нм при логарифмическом усилении. Оптическую калибровку прибора достигают использованием микрочастиц диаметром 96 μm (Bruker). Для анализа берут объем 200 мкл взвеси лимфоидных клеток, причем соотношение Э: М достигают изменением вносимой концентрацией лимфоцитов. Объем вносимой взвеси клеток K-562 во всех пробах составляет 200 мкл при постоянной концентрации. Инкубацию проводят в микропробирках объемом 1,5 мл. Пробу тщательно перемешивают и разделяют пополам для соблюдения установленного стандартизованного соотношения Э:М. В первую пробирку сразу добавляют флуоресцеиндиацетат (ФДА) (Sigma) в растворе PBS в количестве 200 мкл до конечной концентрации 500 нг/мл. Первую пробу оставляют на 20 мин при комнатной температуре, после чего помещают на лед до проведения контрольного исследования. Вторую пробу инкубируют в течение 4 ч при температуре 37^oC в атмосфере с 5% CO₂. Процедуру окрашивания после окончания проводят аналогично контрольной.

С целью оптимизации дискриминантных окон на цитограмме соотношения переднего светорассеяния и интенсивности флуоресценции перед каждой серией исследований отдельно анализируют пробы окрашенных ФДА клеток K-562 и лимфоцитов при установлении стробирующего ("управляющего") сигнала на величину интенсивности флуоресценции. Одновременно опытным путем по каналу наименьшего значения размеров клеток по углу переднего светорассеяния определяют порог этой величины, который затем устанавливают при анализе киллерной активности. В дальнейшем при проведении ЦФТ естественной киллерной активности используют уже как "основной" или "управляющий" сигнал - сигнал переднего светорассеяния. Величиной перекрестной регистрации лимфоцитов в окне подсчета клеток K-562 пренебрегают из-за ее низкого значения (меньше 0,1%) в отличие от большинства известных прототипов с использованием метода проточной цитометрии.

Величину естественной киллерной активности определяют как разницу между числом клеток K-562, зарегистрированных в контрольной и инкубированной пробах в соответствующем окне цитограммы. Подсчет заканчивают после прохождения 100 мкл взвеси клеток дважды, после чего вычисляют среднюю.

По полученным данным в обоих тестах рассчитывают индивидуальные кривые EK-активности с использованием статистико-графической обработки полученных данных на ПЭВМ типа IBM в зависимости от величины соотношения Э:М.

С целью получения положительного результата по применению предлагаемого изобретения предварительно было проведено обоснование отсутствия значимого влияния на естественную киллерную активность лимфоцитов этапа декомпрессии, которому подвергаются пробы периферической крови испытуемых. Минимально необходимое количество проб для этого составило восемь.

Процедура проводилась следующим образом:
забор проб периферической крови объемом примерно 20 мл у каждого из 4 испытуемых производился по общей вышеуказанной схеме, после чего пробы разделялись по 5 мл в отдельные пробирки. Таким образом составлялась контрольная и опытная серии проб по восемь в каждой, причем обе помещались на лед в небольшие контейнеры. Опытная серия подвергалась испытанию по схеме, которая состояла из периодов компрессии, изопрессии и декомпрессии;
компрессия опытной серии проб периферической крови проводилась линейно (исходные условия: давление 0,1 МПа, воздух; pN₂-0,8 МПа, pO₂-0,2 МПа) со скоростью 10 м в мин в гипербарокамере подачей кислородно-гелиевой смеси с содержанием кислорода 0,5% до величины общего давления в 4,1 МПа;
изопрессия под максимальным давлением 4,1 МПа, равном имитационной глубине пребывания группы водолазов, по времени составляла 10 мин, чем устанавливался достаточный уровень насыщения тканей данного типа индифферентными газами;
декомпрессия опытных проб крови с соответствующим обогащением искусственной газовой среды кислородом на этом этапе проводилась по вышеприведенному графику;
в дальнейшем контрольные и опытные серии проб подвергались процедуре выделения лимфоидных клеток и определению цитотоксической активности EK крови в параллельных тестах.

В ходе данного исследования значимого влияния всех перечисленных этапов с использованием указанных процедур по данным статистического анализа не отмечено (p≤0,01), что подтверждает возможность получения результатов при исследовании данного компонента системы иммунитета после предлагаемого способа доставки и декомпрессии проб крови организма при его пребывании в гипербарических условиях в установленных пределах общего давления газовой среды.

положительный эффект от использования изобретения состоял в медикофизиологическом обеспечении пребывания водолазов под заданным давлением, разработке и внедрении способов профилактики и лечения инфекционно-воспалительной патологии водолазов при пребывании под давлением, а также в обосновании реабилитационных мероприятий в послеспусковой период с целью снижения доли "иммунозависимых" заболеваний у лиц данной профессиональной категории.

Способ определения естественной киллерной активности лимфоцитов организма человека при пребывании в условиях гипербарии, заключающийся в использовании цитоксических тестов: цитофлуориметрического - с применением проточного цитометра, оборудованного 100 Вт ртутной лампой, и радиометрического. Для обеспечения достоверности получаемых данных применяется разработанный режим декомпрессии и доставки проб периферической крови испытуемых из гепербарических условий. Использование получаемых параметров с последующей статистической и графической обработкой позволяет определить с большой точностью нарушения естественной киллерной активности лимфоцитов человека в нормальных условиях и в ходе его профессиональной деятельности под повышенным давлением.

Способ определения естественной киллерной активности лимфоцитов человека в условиях гипербарии, включающий выделение лимфоцитов из крови испытуемого и исследование с помощью цитофлоурометрического и радиометрического тестов, отличающийся тем, что пробы крови предварительно подвергают декомпрессии по режиму, исключающему влияние гипербарии, при этом декомпрессию проводят линейно с постоянной скоростью 4 м/мин при величине pO₂ 0,3 - 0,4 атм с подачей расчетного количества кислорода, которое вычисляют по формуле
Q = (P₁ - P₂) • L • V / 100,
где Q - количество кислорода, л;
P₁ - давление в барокамере на предшествующем этапе подачи кислорода, ата;
P₂ - давление в барокамере на последующем этапе подачи кислорода, ата;
L - содержание кислорода в газовой смеси (получалась расчетным путем из суммирования объема кислорода воздуха в исходных условиях и кислорода в поданной газовой смеси на компрессии по отношению ко всему объему полученной газовой смеси на "грунте" и в дальнейшем на этапах декомпрессии);
V - объем гипербарокамеры, л,
а с лимфоцитами пробы крови проводят радиометрический и цитофлоурометрический тесты, по результатам которых определяют киллерную активность лимфоцитарных клеток.