СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ СЫРЬЕ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/04 C07K14/515 

Изобретение относится к молочной, мясной отраслям промышленности, ветеринарии, медицинской промышленности, а именно к количественной оценке белковых веществ.

Ангиогенин - белковый активный фактор роста, впервые получен из культуральной среды клеток человека в 1985 году [1]. Позже обнаружен в различных тканях, сыворотке крови животных и человека, коровьем молоке [2]. Зарубежными исследователями достаточно хорошо изучена структура и биохимические свойства ангиогенина.

Однако количественный метод определения ангиогенина и способы его выделения из молочного сырья являются актуальными, но пока нерешенными задачами.

Известен способ определения ангиогенина в сыворотке крови человека с использованием моноклональных антител [3].

Недостатком его является сложная методика проведения исследований и применение дорогостоящей аппаратуры.

Известен способ определения бычьего ангиогенина в растворах, взятый в качестве прототипа, в котором используется комбинированная проба конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы [4]. Необходимым условием применения данного способа является низкая концентрация панкреатической рибонуклеазы.

Однако этот способ не может быть использован для количественного определения ангиогенина в биологических жидкостях с высоким содержанием панкреатической рибонуклеазы, которая высокогомологична ангиогенину. В связи с этим он не может быть применен для анализа на ангиогенин молочного сырья, содержащего высокие концентрации РНКазы, а именно 10-35 мг/л [5].

Задачей изобретения является разработка достоверного, чувствительного и эффективного способа количественного определения ангиогенина в молочном сырье.

Это достигается хроматографической очисткой сырья от избытка РНКазы перед проведением комбинированной пробы конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы. Согласно изобретению молочное сырье обезжиривают центрифугированием, т.к. содержащийся в нем жир мешает проведению дальнейших процедур. Следующий этап включает хроматографическую очистку исследуемых проб от РНКазы, содержащихся в них в высоких концентрациях, что не позволяет в присутствии больших количеств эндогенной рибонуклеазы определение ангиогенина с помощью комбинированной пробы конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы.

В молоке и в продуктах молочного производства содержание панкреатической РНКазы на порядок выше, чем ангиогенина. Поэтому возникает необходимость снижения концентрации эндогенной рибонуклеазы в молочном сырье до значений, позволяющих при допустимых расходах ингибитора применять комбинированную пробу конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы. Для хроматографической очистки молочного сырья от панкреатической РНКазы в качестве сорбента используют голубую агарозу (Cibacron blue GA Agarose). Хроматография на голубой агарозе позволяет значительно очистить молочное сырье от рибонуклеазы. Общую РНКазную активность сырья до хроматографической очистки на голубой агарозе и после нее определяют против субстрата суммарной дрожжевой РНК. После хроматографии на голубой агарозе молочное сырье анализируют на количество ангиогенина, применяя комбинированную пробу конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы.

Способ осуществляется следующим образом.

Молочное сырье обезжиривают центрифугированием. Затем подвергают хроматографической очистке от избытка панкреатической рибонуклеазы на колонке, заполненной сорбентом голубая агароза. До и после пропускания обезжиренного молочного сырья через колонку с голубой агарозой контролируют в нем содержание панкреатической рибонуклеазы. Количественное содержание ангиогенина определяют, используя комбинированную пробу конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы.

Пример 1. 15 мл коровьего молока обезжиривают центрифугированием (10000 об/мин, 15 мин). Перед хроматографической очисткой определяют общую рибонуклеазную активность При этом используют буфер Трис-HCL, pH 7,0, а в качестве субстрата 1%-ный раствор суммарной дрожжевой РНК. Затем через хроматографическую колонку с внутренним объемом 100 мл, заполненную голубой агарозой, пропускают 2 мл обезжиренного молока. На выходе с колонки получают фракцию, в которой определяют активность остаточной рибонуклеазы против субстрата суммарной дрожжевой РНК. Содержание ангиогенина в молоке определяют, используя комбинированную пробу конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы. О концентрации ангиогенина в молоке судят по количеству не связанной с ингибитором РНКазы. Количественное определение ангиогенина проводится в пятикратной повторности. По результатам анализа в исследуемом образце коровьего молока концентрация ангиогенина составляет 1,2 мг/л.

Пример 2. Осуществляется по примеру 1, используя в качестве сырья для количественного определения ангиогенина молозиво. При этом концентрация ангиогенина в молозиве, согласно способа количественного определения ангиогенина в молочном сырье, составляет 2,2 мг/л.

Пример 3. Осуществляется по примеру 1, используя в качестве сырья для количественного определения ангиогенина стародойное молоко. При этом концентрация ангиогенина в стародойном молоке, согласно способа количественного определения ангиогенина в молочном сырье, составляет 1,6 мг/л.

Пример 4. Осуществляется по примеру 1, используя в качестве сырья для определения ангиогенина козье молоко. При этом концентрация ангиогенина в козьем молоке, согласно способа количественного определения ангиогенина в молочном сырье, составляет 0,27 мг/л.

Сравнительная оценка определения количества ангиогенина в различных видах молочного сырья, согласно способа количественного определения ангиогенина, представлена в таблице.

Анализ данных таблицы свидетельствует о том, что метод является достоверным и может быть применен для различных видов молочного сырья. Предложенный способ, включающий очистку молочного сырья от РНКазы, позволяет оценить содержание ангиогенина в биологических жидкостях с высоким содержанием рибонуклеазы, а именно превышающим содержание ангиогенина в 8-20 раз. Нижний предел чувствительности метода составляет сотые доли мг/л. Достоверность измерений соответствует уровню значимости для биотехнологических процессов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. Fett J. W. , Strydom D.J., Lobb R.R., Aiderman E.V., Bethune J.L., Rioran J.F., Vallee B.L. 1985, Biochemistry, V.24, p.5480-5486.

2. Maes P. , Damart D., Rommens C., e.a., 1988, FEBS Lett, V. 24, p. 41-45.

3. Blaser J. Triebe S., Kopp C., Jscheshe H., 1993, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Bio-chem., V.31, p. 513-516.

4. Bond M.D., 1988, Anai Biochemistry, V.173, p.166-173 (прототип).

5. Шидловская В.П. Ферменты молока. M.: Агропромиздат, 1985, с. 152.

Изобретение относится к молочной, мясной отраслям промышленности, ветеринарии, медицинской промышленности, а именно к количественной оценке белковых веществ. Изобретение позволяет разработать достоверный, чувствительный, эффективный способ количественного определения антиогенина в молочном сырье. Молочное сырье обезжиривают центрифугированием, затем подвергают хроматографической очистке от избытка панкреатической РНКазы на колонке, заполненной сорбентом голубая агароза. До и после пропускания обезжиренного молочного сырья через колонку с голубой агарозой контролируют в нем содержание панкреатической рибонуклеазы. Количественное содержание ангиогенина определяют, используя комбинированную пробу конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы. 1 табл.

Способ количественного определения ангиогенина в биологическом сырье путем проведения комбинированной пробы конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором рибонуклеазы, отличающийся тем, что в качестве биологического сырья используют молоко, перед проведением комбинированной пробы конкурентного взаимодействия молоко обезжиривают центрифугированием, затем проводят хроматографическую очистку от избытка панкреатической рибонуклеазы, используя в качестве сорбента голубую агарозу, при этом определяют общую рибонуклеазную активность до хроматографической очистки на голубой агарозе и после нее против субстрата суммарной дрожжевой РНК.