СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВОЙ ФРАКЦИИ, ОБОГАЩЕННОЙ АНГИОГЕНИНОМ Российский патент 2001 года по МПК A23J1/20 A23C9/148 C07K14/515 

Описание патента на изобретение RU2175195C1

Изобретение относится к способу выделения белковой фракции, содержащей ангиогенин - ценное биологически активное вещество, и может быть использовано в молочной промышленности.

Известно, что ангиогенин коровьего молока представляет собой одноцепочечный белок, состоящий из 125 остатков аминокислот, с молекулярной массой ~ 14 кДа и является мощным стимулятором ангиогенеза (The angiogenins /Strydom D. J. /CMLS). Известно также, что ангиогенин обладает иммунорегуляторной функцией (Ангиогенин и механизм ангиогенеза /Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е. - Новосибирск: Наука, Сибирское предприятие РАН, 1997). Биологическая активность ангиогенина, а также его присутствие в молоке млекопитающих позволяет рассматривать содержащую его фракцию как перспективную биологически активную добавку.

Известен способ выделения ангиогенина из коровьего молока (Патент РФ N 2109748, МПК6 С 07 К 14/515, 1998), включающий очистку молока от жировой фракции, сорбцию белков на ионообменной смоле карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), элюирование белковой фракции с последующим выделением фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм. Затем осуществляют дальнейшую очистку ангиогенина путем гидрофобной хроматографии и последующего диализа.

Недостатком известного способа является использование цельного молока в качестве исходного сырья, которое могло быть использовано на пищевые цели: для выделения 3,27 мг чистого ангиогенина требуется 3 л молока, а также длительность и многоэтапность очистки. Кроме того, в известном способе выделенная фракция содержит три группы белков: с молекулярной массой 14,3-17,8 кДа, 45 кДа и 67 кДа, т.е. смесь белков, из которой далее выделяют чистый ангиогенин.

В то же время известно, что в молочной промышленности при производстве молочных продуктов образуется большое количество побочных продуктов, таких как сыворотка, пахта, ультрафильтрат, которые не всегда находят дальнейшее применение. Широкое распространение ультрафильтрационных методов обработки привело к увеличению количества вырабатываемого ультрафильтрата, который в большинстве случаев не подвергается дальнейшей переработке, а отдается в натуральном виде на корм скоту (Мембранные и молекулярно-ситовые методы переработки молока /Фетисов Е.А., Чагаровский А.П. - М.: Агропромиздат, 1991.-272 с. ). Таким образом, применение молочного ультрафильтрата для выделения биологически активных веществ является актуальным и обладает практической значимостью.

Задачей изобретения является разработка эффективного и дешевого способа выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином, на основе вторичного молочного сырья, а именно молочного ультрафильтрата.

Поставленная задача достигается способом, включающим осаждение молочного ультрафильтрата, в частности насыщенным раствором сульфата аммония при 4oC, отделение осадка путем центрифугирования, диализ против воды и против 0,05М натрий-фосфатного буфера, гель-фильтрацию путем нанесения диализованного ультрафильтрата на ионообменную колонку, содержащую в качестве сорбента сефадекс, с последующим элюированием с помощью раствора 0,2 М хлорида натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере со значением pH 6,7 со скоростью не более 3-4 мл/ч и выделением фракции с оптической плотность при длине волны 280 нм более 0,1.

Предпочтительно центрифугирование проводят со скоростью не менее 12000 об/мин в течение не более 1 ч.

Диализ предпочтительно проводят при температуре не более 8oC в течение 10-12 ч.

Предлагаемый способ предусматривает использование для получения фракции, обогащенной ценным биологически активным веществом ангиогенином, вторичного молочного сырья, а именно молочного ультрафильтрата, наиболее дешевого и наименее применяемого в производстве вторичного сырья. Поскольку концентрация ангиогенина в цельном молоке составляет до 8 мг/л (Количественный анализ ангиогенина в молоке коров /Тихомирова Н.А. - Молочная промышленность, N 10, 1999), а выход ангиогенина в ультрафильтрат - до 45-60%, использование именно этого вторичного сырья представляет большой практический интерес.

Для выделения обогащенной ангиогенином белковой фракции впервые в качестве сорбента использован известный сорбент на основе декстранов - сефадекс G-75 сверхтонкий с размером частиц сухого геля 10-40 мкм. В отличие от известного способа применение этого сорбента позволило выделить белковую фракцию только с одной группой белков с молекулярной массой 12,3-14,3 кДа, что было подтверждено электрофоретическим методом.

Предлагаемый способ обеспечивает получение из молочного ультрафильтрата белковой фракции, содержащей ангиогенин в количестве ~ 3,3 мг/л, которую далее можно использовать в качестве биологически активной добавки в производстве новых молочных продуктов, и тем самым комплексно использовать молочное сырье.

Способ осуществляется следующим образом.

Молочный ультрафильтрат осаждается насыщенным раствором сульфата аммония при температуре 4oC, осадок отделяется путем центрифугирования, диализируется против воды и против 0,05М натрий фосфатного буфера, проводится гель-фильтрация путем нанесения диализованного ультрафильтрата на ионнообменную колонку, содержащую в качестве сорбента сефадекс, с последующим элюированием с помощью раствора 0,2 М хлорида натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере со значением pH 6,7 со скоростью не более 3-4 мл/ч. Все фракции с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 объединяют.

Пример 1.

2 л ультрафильтрата, полученного в результате ультрафильтрации цельного молока при производстве детского творога, осаждали 65% насыщенным раствором сульфата аммония в течение двух суток при температуре 4oC. Образовавшийся осадок центрифугировали со скоростью 12000 об/мин в течение 50 мин и диализовали против воды и 0,05 М натрий-фосфатного буфера с pH 6,7 в течение 10 часов при температуре 4oC. Определяли содержание белка в диализованном ультрафильтрате по методу Лоури, которое составило 8 мг белка на 1 мл ультрафильтрата. Затем подготовленным сефадексом заполняли колонку размером (1,5х95)см и наносили диализованный ультрафильтрат.

Элюирование проводили раствором 0,2 М хлористого натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с pH 6,7 со скоростью 3 мл/ч. Выделяли белковую фракцию с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм. Выход ангиогенина составил 67%. Определяли концентрацию ангиогенина в выделенной фракции по количественному методу определения ангиогенина в биологическом сырье (Патент РФ N 2110066, МПК6 G 01 N 33/04, 1998). Концентрация ангиогенина составила 3,35 мг/л.

Пример 2.

2 л ультрафильтрата, полученного в результате ультрафильтрации цельного молока при производстве детского творога, осаждали 100% насыщенным раствором сульфата аммония в течение двух суток при температуре 4oC. Образовавшийся осадок центрифугировали при 14000 об/мин в течение 35 мин и диализовали против воды и 0,05 М натрий-фосфатного буфера с pH 6,7 в течение 12 часов при температуре 8oC. Определяли содержание белка в диализованном ультрафильтрате по методу Лоури, которое составило 8 мг белка на 1 мл ультрафильтрата. Затем подготовленным сефадексом заполняли колонку размером (1,5х95)см и наносили диализованный ультрафильтрат.

Элюирование проводили раствором 0,2 М хлористого натрия в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с pH 6,7 со скоростью 4 мл/ч. Выделяли белковую фракцию с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм. Выход составил 72,8%. Концентрация ангиогенина составила 3,64 мг/л.

Сравнительный пример.

Свежее цельное молоко в количестве 2 л обезжиривали центрифугированием (3000 об/мин, 30 мин) при 4oC. Обезжиренное молоко суспендировали в предварительно подготовленную карбоксиметилцеллюлозу. Затем измеряли значение pH смеси и, если это необходимо, доводили его до значения 6,7 с помощью 0,1 М соляной кислотой. Сорбцию вели в течение одного часа при температуре 4oC. После сорбции отделяли сорбент от жидкой фазы, промывали его пятью объемами 0,05 М натрий-фосфатного буфера, pH 6,7, при объемном соотношении карбоксиметилцеллюлоза : буфер = 1 : 5. Затем сорбент помещали в ионообменную колонку размером (2,5х50)см. Колонку промывали 0,2 л того же буфера со скоростью 200 мл/ч и элюировали белки смесью хлорида натрия и натрий-фосфатного буфера со скоростью 100 мл/ч. Собирали фракции объемом 10 мл и все фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм объединяли.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет использовать молочный ультрафильтрат в качестве дешевого исходного сырья для получения ангиогенина, а также выделять белковую фракцию, содержащую ангиогенин, с использованием сефадекса в качестве сорбента. Полученную белковую фракцию можно использовать как биологически активную добавку при производстве молочных продуктов, в особенности для повышения биологической ценности стерилизованных молочных продуктов.

Похожие патенты RU2175195C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ "МИЛКАНГ" И ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ БАД "МИЛКАНГ" 2000
  • Рогов И.А.
  • Титов Е.И.
  • Шалыгина А.М.
  • Тихомирова Н.А.
  • Комолова Г.С.
  • Рогов С.И.
RU2183935C2
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА 1996
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Комолова Г.С.
  • Михайлов А.М.
  • Тихомирова Н.А.
RU2109748C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ "МОБЕЛИЗ" И ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ БАД "МОБЕЛИЗ" 2008
  • Семенов Геннадий Вячеславович
  • Тихомирова Наталья Александровна
  • Комолова Галина Сергеевна
  • Овчинникова Ольга Евгеньевна
RU2366294C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАД ИЗ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КАТИОННЫХ БЕЛКОВ МОЛОКА И ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ БАД 2006
  • Рогов Иосиф Александрович
  • Титов Евгений Иванович
  • Семенов Геннадий Вячеславович
  • Тихомирова Наталья Александровна
  • Комолова Галина Сергеевна
  • Ионова Инна Исааковна
  • Лепихина Ольга Евгеньевна
RU2318406C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО БЕЛКОВОГО КОНЦЕНТРАТА, ОБОГАЩЕННОГО ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗОЙ А, АНГИОГЕНИНОМ И ЛИЗОЦИМОМ, ИЗ МОЛОЧНОГО УЛЬТРАФИЛЬТРАТА 2001
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Тихомирова Н.А.
  • Комолова Г.С.
  • Федорова Т.В.
  • Машков А.Е.
  • Цуман В.Г.
  • Пыхтеев Д.А.
  • Плаксина Г.В.
RU2204262C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАД "Л-ПФИ" ИЗ ВТОРИЧНОГО МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ И ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ БАД "Л-ПФИ" 2009
  • Семенов Геннадий Вячеславович
  • Тихомирова Наталья Александровна
  • Комолова Галина Сергеевна
  • Ильина Анна Михайловна
RU2400106C1
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ СЫРЬЕ 1996
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Комолова Г.С.
  • Ионова И.И.
  • Тихомирова Н.А.
  • Рустамьян Ю.Л.
RU2110066C1
СТЕРИЛИЗОВАННОЕ МОЛОКО, ОБОГАЩЕННОЕ АНГИОГЕНИНОМ 2000
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Тихомирова Н.А.
  • Комолова Г.С.
  • Куркина О.С.
RU2182791C2
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА В МОЛОЧНОМ СЫРЬЕ 1998
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Комолова Г.С.
  • Рустамьян Ю.Л.
  • Тихомирова Н.А.
  • Ионова И.И.
RU2133464C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА-ГАММА ЧЕЛОВЕКА 1997
  • Закабунин А.И.
  • Барановская Г.А.
  • Пустошилова Н.М.
  • Майстренко В.Ф.
  • Гаврюченкова Л.П.
  • Громова О.А.
RU2132386C1

Реферат патента 2001 года СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВОЙ ФРАКЦИИ, ОБОГАЩЕННОЙ АНГИОГЕНИНОМ

Изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано для выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином. Молочный ультрафильтрат осаждают насыщенным раствором сульфата аммония преимущественно при 3-5°С. Центрифугируют преимущественно со скоростью не менее 12000 об/мин в течение 0,5-1,5 ч и проводят двойной диализ преимущественно при 7-9°С в течение 10-12 ч против воды и против натрий-фосфатного буфера с последующей сорбцией белков и элюированием белковой фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм, при этом в качестве сорбента используют сефадекс G75. Изобретение позволяет повысить эффективность выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином, и снизить затраты. 5 з.п.ф-лы.

Формула изобретения RU 2 175 195 C1

1. Способ выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином, из молочного сырья, включающий сорбцию белков и элюирование белковой фракции с оптической плотностью более 0,1 при длине волны 280 нм, отличающийся тем, что в качестве молочного сырья используют молочный ультрафильтрат и в качестве сорбента - сефадекс G-75, предварительно осуществляют осаждение ультрафильтрата насыщенным раствором сульфата аммония с последующим центрифугированием и двойным диализом против воды и против натрий-фосфатного буфера. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что элюирование проводят со скоростью 3 - 4 мл/ч. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что осаждение проводят при 3 - 5oC. 4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что центрифугирование проводят со скоростью не менее 12000 об./мин. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что центрифугирование проводят 0,5 - 1,5 ч. 6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что диализ проводят при 7 - 9oC в течение 10 - 12 ч.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2001 года RU2175195C1

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА 1996
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Комолова Г.С.
  • Михайлов А.М.
  • Тихомирова Н.А.
RU2109748C1
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА В МОЛОЧНОМ СЫРЬЕ 1998
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Комолова Г.С.
  • Рустамьян Ю.Л.
  • Тихомирова Н.А.
  • Ионова И.И.
RU2133464C1
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ СЫРЬЕ 1996
  • Рогов И.А.
  • Шалыгина А.М.
  • Комолова Г.С.
  • Ионова И.И.
  • Тихомирова Н.А.
  • Рустамьян Ю.Л.
RU2110066C1
BOND M.D., VALEE B.L
JSOLATION OF BOVINE ANGIOGENIN USING A PLACENTAL RIBONUCLEASE INHIBITOR BINDING USSAG, BIOCHEMISTRY, V.27, N 17, H.6282-6287, 1987.

RU 2 175 195 C1

Авторы

Рогов И.А.

Шалыгина А.М.

Комолова Г.С.

Тихомирова Н.А.

Куркина О.С.

Даты

2001-10-27Публикация

2000-06-23Подача