Способ получения большого фрагмента ДНК-полимеразы I ЕSснеRIснIа coLI - фрагмента Кленова Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 C12N9/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в .частности к способам получения ферментов для обеспечения генно-инженерных работ.

Цель изобретения - повышение выхода, удельной активности и качества очистки фермента.

Основу предложенного способа и его главную отличительную черту, обеспечивающую достижение поставленной цели, составляет новая совокупность методических приемов на стадии хроматографической очистки ферментного препарата.

После фракционирования фермента сульфатом аммония проводят хроматографию на колонке с ион-гидрофобным сорбентом - солозой КГ 8/24 с элюци- ей активного белка линейным гради

ентом КС 1 от 0 до 1 М в буферном растворе. После этой стадии выход фрагмента Кленова достигает 75-80%, а очистка - 30 раз. На втором этапе хроматографической очистки используют колонку с красно-коричневым 2К,- иммобилизованном на CL-сефарозе 6В через декстран, и тот же принцип элю ции, что и на первой стадии. После второго этапа хроматографической очистки выход фермента составляет 60-65%, а очистка - 150 раз.

Чистота препарата по данным электрофореза в ПАА-геле составляет 96,2%. Полученный препарат имеет удельную активность 15000 ед./мг (при определении с ДНК тимуса теленка) и 90000 ед./мг (при определении с ДНК лосося), что в 2-3 раза выше, чем при получении фермента известным способом. Фрагмент Кленова, очищенный предложенным способом, отвечает современным требованиям к этому препарату и может быть использован в секвенировании ДНК методом Сэнгера и в сайт-специфическом мутагенезе при решении задач белковой инженерии.

Пример 1. Получение сорбента - солозы КГ 8/24.

Приготовление дисперсионной среды Б реактор, снабженный мешалкой, обратным холодильником .и термометром, вводят 325 мл тридекана и стабилизаторы суспензии (9 мл) Span-85 и (0,7 мл) Tween-85, перемешивают при комнатной температуре в атмосфере аргона.

Приготовление дисперсной фазы. В отдельной емкости проводят растворение в смеси (30 мл) диметилформ амида и (42 мл) воды следующих компонентов: метакриловая кислота 4,1 мл; метиленбисакриламид 2,7 мл; персуль- фит аммония 1,03 г и бутилметакрилат 1,1 мл. Перемешивают при комнатной температуре. Полученный раствор представляет собой дисперсную фазу.

Формирование эмульсии и полимери- зация. В дисперсионную среду при перемешивании и барботаже аргоном вводят дисперсную фазу, включают обогре реактора и проводят полимеризацию пр 70°С в течение 5 ч. Далее гранулы

сорбента отделяют фильтрованием, отмывают водой и детергентом, и далее дистиллированной водой. Фракциони

0

0

5

0 5

руют мокрым рассевом на ситах, выделяя фракцию 80-120 мкМ.

Получение аффинного сорбента - CL-сефарозы 6В - красно-коричневый 2К. К 180 мл CL-сефарозы 6В производства фирмы Фармация (Швеция) прибавляют 40 мл воды, нагревают до 60 С и при перемешивании механической мешалкой прибавляют небольшими порциями 478 мг красно-коричневого 2К, растворенного в 20 мл воды. После перемешивания в течение 30 мин прибавляют 24 г NaCl и перемешивают при 5 60 С еще 1 ч. Смесь нагревают до

80°С, прибавляют 2,1 г Na2C03, перемешивают 2 ч, фильтруют и отмывают холодной и горячей (80°С) водой до получения бесцветного фильтрата. Получается сорбент, содержащий 1,7 мкМ красителя красно-коричневого 2К на 1 мл CL-сефарозы 6В. Приготовленный сорбент CL-сефароза 6В - красно-коричневый 2К имеет формулуг,

QHСШН

-ЪNf rVN N- ч

Na03S-(3-NH-f VNH-k

0

5

0

5

NyN

so3Ma

O-СефАрОЗА CL-6B Для определения концентрации крас- но-коричневого 2К на сефароэе в элю- энте измеряют оптическую плотность при 525 нм и согласно молярному коэффициенту экстинкции красителя (13500 ), находят количество непрореагировавшего красно-коричневого 2К. Из разницы между взятым количеством красно-коричневого 2К и найденным в элюэнте находят количество лиганда в микромолях на I мл сефарозы.

Выделение и очистка фрагмента Кленова. Получение ферментного экстракта. 50 г клеток E.coli суспендируют в 200 мл 0,05 М трис-HCl рН 7,5 буфера, содержащего 0,002 М ЭДТА, 0,001 М дитиотрейтола, 0,02 мМ фе- нилметилсульфонилфторида и 1 мг/мл лизоцима. Суспензию выдерживают 15 мин в ледяной бане и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН- 2Т. Обломки клеток осаждают центрифугированием при 48000 g в течение 1 ч. Выпавший осадок отбрасывают, центри- фугат (215 мл) используют для выделения фермента.

Фракционирование ферментного экстракта полимином Р и сульфатом аммония. К центрифугату (215 мл), полученному на предыдущей стадии, при постоянном перемешивании в течение 30 мин добавляют 10%-ный (13,7 мл) раствор полимина Р до конечной концентрации 0,6%. После добавления всего объема полимина перемешивание продолжают еще 30 мин. Экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 4000 g. Полученный осадок используют для получения фрагмента Кленова. Фермент экстрагируют из осадка 100 мл 0,1 М калий-фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 0,001 М Ј -меркаптоэтанол, 0,002 М ЭДТА, 0,1 М NaCl. Процедуру повторяют еще раз. Супернатанты объединяют. Экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 4000 g. К супер- натанту (230 мл), медленно перемешивая, добавляют сухой сульфат аммония до 60% насыщения, смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин, Раствор центрифугируют в течение 15 мин при 21000 g. Осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 85%-ного насыщения. Осадок собирают, растворяют в 20 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,001 М -меркаптоэтанола, помещают в диализную трубку и диализуют в течение 18 ч против 2 л указанного буфера. Получают 34 мл диализата.

Хроматография фрагмента Кленова на колонке с солозой КГ 8/24. Диализат фермента (34 мл) подвергают хроматографии на колонке (1, см) с

солозой КГ 8/24, уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствора колонку промывают 150 мл исходного буфера. Элюиро- вание фермента осуществляют линейным

градиентом (450 мл) КС1 от 0 до 1,0 М в исходном буфере. Собирают фракции по 9 мл. Фрагмент Кленова элюируется в пределах 0,4-0,6 М КС1. Активные фракции объединяют. Получают 50 мл ферментного раствора, который диали- эуют в течение 18 ч против 2 л 0,01 М трис-HCl буфера рН 7,5, содержащего 0,01 М MgCl, 0,01 М /1-мер- каптоэтанола и 6% глицерина. Получают 50 мл диализата.

Хроматография фермента на колонке с CL-сефарозой 6В - красно-коричневый 2К. Диализат фрагмента Кленова (50 мл) подвергают хроматографии на колонке (1, см) с CL-сефарозой 6В - красно-коричневый 2К,

0

5

0

5

5

0

0

уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствор, колонку промывают 75 мл исходного буфера. Элюирование фермента осуществляют линейным градиентом (250 мл) КС1 от 0 до 1,0 Мв исходном буфере. Собирают фракции по 5 мл. Фрагмент Кленова элюируется в пределах 0,25-0,6 М КС1. Активные фракции объединяют и используют для концентрирования.

Концентрирование конечного препарата. Объединенные фракции диализуют против 50 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,5 мМ дитиотрейтола и 50% глицерина (по объему). Диализ продолжают в течение 12 ч. Препарат помещают в предварительно охлажденную емкость и хранят при -20°С..Выход фрагмента Кленова составляет 6000 ед./г биомассы с удельной активностью 15000 ед./мг белка.

Активность фрагмента Кленова определяют по включению в активированную тимусную ДНК (обработанную панкреатической дезоксирибонуклеазой). За единицу активности принимается то количество фрагмента Кленова, которое при температуре 37 С за 30 мин включает 10 нмоль дезоксирибонукле- озидфосфатов в ДНК-матрицу.

П р и м е р 2. Способ получения фрагмента Кленова осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с солозой КГ 8/24 используют исходный буфер, содержащий 0,005 М калий-фосфат pF 6,5 и 0,0005 М fl-меркаптоэтанол, а при хроматографии на колонке с CL-сефа- роэой 6В - красно-коричневый 2К используют сорбент, содержащий 1,2 мкМ красителя/мл сефарозы, а исходный бу- 5 Фер содержит 0,005 М трис-HCl-буфер рН 7,0; 0,005 К MgClz уз-меркаптоэта- нол и 5%-ный глицерин. Выход фермента составляет 5000 ед./г биомассы с удельной активностью 13000 ед./мг белка.

Пример 3. Способ получения фрагмента Кленова осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с солозой КГ , 8/24 используют 0,05 М калий-фосфат рН 7,5 и 0,005 М /1-меркаптоэтанол, а при хроматографии на колонке с CL-сефарозой 6В - красно-коричневый 2К используют сорбент, содержащий ,

0

5

2,4 мкМ красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит 0,05 М трис- НС1-буфер рН 7,8; 0,05 М MgCla , 0,05 М /ь-меркаптоэтанол и 10%-ный глицерин. Выход фермента составляет 5470 ед./г биомассы с удельной активностью 14000 ед./мг белка.

Результаты получения фермента по предлагаемому способу представлены в таблице,

Таким образом, преимущество предложенного способа заключается в возможности получения высокоочищенного препарата с более высокими выходом и удельной активностью, чем при использовании известных способов.

Применение изобретения имеет большое значение в решении задачи обеспечения генно-инженерных работ в нашей стране необходимым количеством фрагмента Кленова высокого качества.

0

5

0

фрагмента Кленова, включающий разрушение бактериальных клеток, осаждение нуклеиновых кислот и связанных с ними белков полимином Р, экстракцию осадка раствором хлористого натрия, фракционирование сульфатом аммония и хроматографическую очистку конечного продукта, отличающий с я тем, что, с целью повышения выхода, удельной активности и качества очистки фермента, хроматографическую очистку проводят в две стадии: на колонке с солозой КГ 8/24 и элюцией линейным градиентом КС1 от 0 до 1 М в буферном растворе, а затем на колонке с CL-сефарозой 6В, связанной с красителем красно-коричневым 2К, и элюцией линейным градиентом КС1 от О до 1 М в буферном растворе,

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве буфера при хроматографии на колонке с солозой КГ 8/24 используют 0,005- 0,05 М К-фосфатный буфер с рН 6,5- 7,5, содержащий 0,0005-0,005 М -мер- каптоэтанол.

3,Способ по п, 1 j, отличаю щ и и с я тем, что в качестве буфе

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам получения ферментов для обеспечения генно-инженерных работ. Целью изобретения является повышение выхода, удельной активности и качества очистки фермента. Отличительная черта предложенного способа получения фрагмента Кленова, обеспечивающая достижение цели, - новая совокупность методических приемов на стадии хроматографической очистки ферментного препарата. Хроматографию проводят в 2 этапа: сначала на клонке с ион-гидрофобным сорбентом - солозой КГ 8/24 и элюцией активного белка линейным градиентом KSL от 0 до 1 М в буферном растворе

затем - на колонке с красителем красно-коричневым 2К, иммобилизованным на CL-сефарозе 6В через декстран и тем же, что и в первом случае, способом элюции. Выход препарата составляет 65%, удельная активность (при определении с ДНК тимуса теленка) 15000 ед/мг, чистота - 96,2%. Фрагмент Кленова, полученный новым способом, может быть использован для всех видов генно-инженерных работ. Применение изо

Формула изобретения 1. Способ получения большого фрагмента ДНК-полимеразы I Escherichia coliра при хроматографии на колонке с CL-сефарозой - красно-коричневым 2К используют 0,005-0,05 М трис-НС1- буфер с рН 7,0-7,8, содержащий 0,005- 0,05 М MgCU, 0,005-0,05 М /з-меркап- тоэтанол и 5-10%-ный глицерин.