СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С Российский патент 1997 года по МПК C12P21/00 C07K14/80 A61K35/34 

Изобретение относится к химии биологически активных веществ белковой природы, более точно к выделению металлопротеида цитохрома C из мышц сердца крупного рогатого скота. Цитохром C нашел широкое использование в медицине, ветеринарии в качестве лекарственного препарата, а также в виде реактива в биохимии.

Изобретение может использоваться при выделении цитохрома C в промышленных масштабах.

Цитохром C белок, содержащий железо, может быть выделен из разнообразных видов природного сырья: дрожжей, риса, мышц сердца млекопитающих (лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов, человека), птиц (голубей, пингвинов), рыб и т.д.

Стоимость 1 г цитохрома C высокой чистоты в зависимости от источника выделения и метода получения составляет от 108,6 до 247,7 долларов США (каталоги фирм Флока 1993/94, Олдрич 1992/93, Сигма 1994).

Описаны способы получения цитохрома C из различных природных источников, в первую очередь из такого широко распространенного сырья как мышцы сердца млекопитающих, предпочтительно крупного рогатого скота. Известен способ получения цитохрома C из бычьих сердец (1), включающий следующие стадии.

1. Свежие сердца крупного рогатого скота обезжиривают, удаляют сосуды и связки, измельчают, отмывают водой от крови.

2. Полученный фарш экстрагируют 1,0 н. водным раствором уксусной кислоты, pH смеси 4,3.

3. Смесь выдерживают 1 ч при 4^oC, добавляют 1 н. водный раствор NH₄OH до pH 6,0 и при той же температуре выдерживают сутки, затем отделяют фильтрат.

4. В фильтрат добавляют фосфатный буферный раствор с pH 7,4 в таком количестве, чтобы его конечная концентрация составила 0,02 М.

5. Фильтрат пропускают через колонку с сорбентом, в качестве которого берут алюмосиликат магния.

6. Сорбент промывают 1,0% раствором сульфата алюминия, содержащего 0,02 М фосфатный буфер с pH 7,4.

7. 5,0 мас. раствором сульфата аммония, содержащего 0,02 M фосфатный буфер, элюируют цитохром C с отбором фракций, окрашенных в красный цвет.

8. Эти фракции объединяют, разбавляют водой в 5 раз и еще дважды рехроматографируют в тех же условиях.

9. Показатель чистоты цитохрома C в полученном конечном водном элюате оценивают как отношение экстинкций раствора цитохрома C в восстановленной форме при длине волны 550 нм и раствора цитохрома C в окисленной форме при длине волны 280 нм, эта величина для продукта, полученного описанным способом, составляет 1,10.

Данный способ характеризуется относительно малой емкостью сорбции используемого сорбента алюмосиликата магния: не более 4,5 5 мг/мл или 13 - 15 мг/г. Это приводит к необходимости использовать 200 250 мл сорбента на 1 кг сырья. Выход очищенного цитохрома C не превышает в известном способе 74% от того количества, которое было получено после первой хроматографии, где показатель чистоты находился в пределах 0,45 0,67. Из-за многостадийной операции хроматографирования известный способ практически невозможно масштабировать.

Описан также способ получения цитохрома C с использованием хроматографии на карбоксильных смолах катионитах (2) (ближайший аналог). Этот способ реализуется следующей совокупностью существенных признаков:
1. Свежие сердца крупного рогатого скота обезжиривают, удаляют сосуды и связки, измельчают, отмывают от крови.

2. Полученный фарш экстрагируют 1,0 н. водным раствором уксусной кислоты, pH полученной смеси 4,3.

3. Смесь выдерживают 1 ч при 12 15^oC и добавляют 4 н. водный раствор NH₄OH до pH 6,5, а затем 400 г порошковатого сульфата аммония на 1 кг исходного сырья, через 3 ч выдержки при 20^oC или через сутки при 4^oC экстракт отделяют.

4. В экстракт добавляют 30% раствор NH₄OH до pH 7,0, затем порциями добавляют порошкообразный сульфат аммония при полном растворении каждой порции до получения раствора плотностью 1,220, после чего суспензию фильтруют.

5. Фильтрат яркокрасный раствор, содержащий 80% от насыщенного раствора сульфата аммоний с pH 6,8, охлаждают до 2 4^oC и добавляют 3 н. раствор трихлоруксусной кислоты до pH 4,8 5,0.

6. Осадок отделяют, промывают раствором сульфата аммония с концентрацией 90% от насыщенного, ресуспендируют в воде и устанавливают pH, равное 7,0, добавлением 30% раствора NH₄OH.

7. Суспензию отделяют, фильтрат диализуют против дистиллированной воды.

8. Диализованный раствор окисляют малым количеством 0,01 M калия феррицианида до исчезновения полосы восстановленной формы цитохрома C при 550 нм, раствор сорбируют на карбоксильном катионите Амберлит ХЕ-64 в H⁺-форме, уравновешенном 0,25 н. аммонийфосфатным буфером с pH 7,0.

9. Сорбент промывают 0,125 н. аммоний-фосфатным буфером с pH 7,0.

10. Ту часть смолы, которая в результате сорбции цитохрома C окрасилась в красный цвет, извлекают из колонки, суспендируют в 0,02 н. буферном растворе и переносят в колонку меньшего размера.

11. 0,5 н. буферным раствором с pH 7,0 элюируют цитохром C, в элюат добавляют небольшое количество 0,01 М калия феррицианида, разбавляют равным объемом воды и пропускают через тот же сорбент, уравновешенный 0,25 н. аммоний-фосфатным буфером с pH 7,0.

12. Элюцию ведут 0,25 н. буферным раствором с pH 7,0, содержащим 0,01 М раствор калий феррицианида.

13. Элюент, содержащий цитохром C, диализуют против дистиллированной воды и вновь ведут адсорбцию на Амберлите ХЕ-64 в H⁺-форме.

14. После сорбции часть смолы, окрашенной в красный цвет, переносят в меньшую по размеру колонку.

15. Элюцию ведут 5% раствором сульфата аммония в pH 8,0.

Показатель чистоты полученного конечного продукта до 1,25, выход до 52,4% от имевшегося в растворе после первой обработки сульфатом аммония.

В известном способе цитохром C выделяют методом сорбции на карбоксильном катионите Маберлит ХЕ-64, представляющем сополимер метакриловой кислоты с дивинилбензолом (5%). Этот сорбент специально подготовлен для использования в фармацевтической промышленности (3). Сорбцию цитохрома C проводят на Маберлите ХЕ-64 в H⁺-форме, поскольку экспериментально установлено, что высокая емкость сорбции и достаточная селективность достигаются на карбоксильных катионитах в H⁺-форме сорбента.

Кроме того, хроматографирование может быть эффективно только при использовании цитохрома C в окисленной форме (4, 5), поскольку еще раньше было найдено, что восстановленная форма цитохрома C обладает малым сродством к сорбентам. Известная технология выделения цитохрома C предусматривает не только окисление самого выделяемого продукта, но и предобработку карбоксильного катионита 5% раствором натрий гипохлорита, которая предупреждает восстановление окисленной формы цитохрома C в процессе выделения.

Низкая емкость сорбции карбоксильного катионита даже в окисленной форме: она не превышает 1,5 мг/мл сорбента (100 мл Амберлита ХЕ-64 на 125 мг цитохрома C) или около 4,5 мг/г сорбента.

В известном способе не указана величина обратимости процесса сорбции-десорбции. Однако эксперименты показали, что введение в состав сорбента таких гидрофобных групп как ароматические ядра и/или метильные группировки значительно уменьшает обратимость сорбции. В описании известного способа указано, что даже после однократного использования сорбента его необходимо регенерировать не только обычными реагентами водными растворами едкого натра и соляной кислоты, но и раствором натрий гипохлорита до полного обесцвечивания, которое иначе не достичь
Известный способ сложно масштабировать из-за многостадийности: только процесс сорбции-десорбции используется четырежды.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа получения цитохрома C, который может быть легко масштабирован, с однократной хроматографической очисткой целевого продукта на сорбенте, гарантирующем высокую обратимость сорбции и повышенную емкость сорбции и селективность при сохранении высокой степени чистоты промышленно получаемого продукта. При этом сорбент должен обеспечивать высокую емкость и селективность вне зависимости от формы цитохрома C (окисленной или восстановленной).

Эта задача была решена способом получения цитохрома C, который включает следующую совокупность существенных признаков.

1. Свежие сердца крупного рогатого скота обезжиривают, удаляют сосуды и связки, измельчают, отмывают водой от крови.

2. Измельченное сырье обрабатывают разбавленным раствором сильной кислоты при pH 3,9 4,2 в течение 1,5 2 ч при 10 15^oC, экстракт отделяют от сырья.

3. В качестве разбавленных растворов сильных кислот берут 0,10 0,15% водный раствор серной кислоты или 2,0 2,5% водный раствор трихлоруксусной кислоты.

4. В отфильтрованном экстракте добавлением 10 15 мас. раствора едкого натра устанавливают pH 6,8 7,4 и пропускают через карбоксильный катионит в Na⁺-форме, уравновешенный солевым раствором с ионной силой 0,1.

5. В качестве карбоксильного катионита используют сополимер метакриловой кислоты с 3 5% N,N'-гексаметилендиметакриламида или сополимер акриловой кислоты и дивинилбензола (6).

6. После завершения сорбции катионит промывают водным раствором сульфата аммония с концентрацией 0,5 0,8%
7. Элюцию целевого продукта ведут 10 12 мас. водным раствором сульфата аммония с pH 9,0 9,8, устанавливая его 1 н. раствором NH₄OH, отбирая фракции.

8. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют, подкислением 20% серной кислотой устанавливают pH 7,2 7,5, затем порциями добавляют порошкообразный сульфат аммония в количестве 0,5 г/мл элюата и перемешивают до полного растворения, выпавшие балластные белки отделяют, процесс осаждения повторяют до достижения показателя чистоты цитохрома C в растворе не менее 0,8.

9. К полученному охлажденному до 5 10^oC фильтрату добавляют 20 25 мл/л 20 мас. раствора трихлоруксусной кислоты, при той же температуре выдерживают раствор до выпадения осадка, который отделяют.

10. Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления иона SO2-4

Для данного способа характерно следующее.

1. Используют карбоксильные катиониты в Na⁺-форме с емкостью сорбции по цитохрому C до 615 1490 мг/г сухой смолы при обратимости сорбции 85 98% (известные катиониты, например КМД (8), являющийся сополимером стирола с дивинилбензолом, хлорметилированный и карбоксилированный, характеризуются емкостью сорбции чистого цитрохрома C около 50 60 мг/мл сорбента при обратимости сорбции 30 43%).

2. Процесс хроматографирования проводят без перевода цитохрома C в окисленную форму и без предобработки экстракта и сорбента.

Таким образом, способ основан на обнаруженной впервые новой, неочевидной функции у выбранных для выделения цитохрома C карбоксильных катионитов, что позволило разработать новую промышленную технологию.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез сополимера метакриловой кислоты и N, N'-гексаметилендиметакриламида.

516 г метакриловой кислоты и 79,5 г N, N'-гексаметилендиметакриламида растворяют в 2,33 л 20% водной уксусной кислоты. При перемешивании в инертной атмосфере вводят 3,06 г персульфата аммония и 2,34 г аскорбиновой кислоты. Образовавшийся блок прогревают при 100^oC в течение 30 мин. Сополимер измельчают, обрабатывают 1 н. едким натром (3 х 9 л), затем 1 н. соляной кислотой (1 х 9 л), отмывают водой и сушат. Выход 566 г или 95% Коэффициент набухания в воде K_наб. 5,0, в буферном растворе с pH 6,8 K_наб. 10,0. Емкость по иону натрия 9,4 мг•экв/г сухой смолы. Полученный карбоксильный катионит хранится в H⁺-форме. Для выделения цитохрома C его переводят в Na⁺-форму действием избытка 1 н. едкого натра с последующим отмыванием водой до pH на выходе колонки 7,0 8,5 и уравновешиванием солевым раствором ионной силы 0,1 (5,6 г/л хлористого натрия или 5 г/л сульфата аммония).

Пример 2.

7,5 кг фарша, полученного из сердечных мышц крупного рогатого скота после обезжиривания, удаления сосудов, связок и измельчения, отмывают водой от остатков крови и экстрагируют 10,0 л 0,125 мас. водного раствора серной кислоты. Экстракцию ведут 2 ч при 10^oC, pH полученного экстракта 4,1. Экстракт отделяют от исходного сырья прессованием. Всего получают 6,5 л экстракта. Добавкой 15% водного раствора едкого натра устанавливают pH экстракта 6,8. Полученный раствор пропускают через сорбент, полученный по примеру 1. Объем колонки 250 мл (диаметр 6 см, высота слоя сорбента 8,5 см, количество сорбента 240 мл или 24 г сухой смолы). Сорбцию ведут при скорости пропускания раствора 3,0 л/ч. Время сорбции около 4,5 ч. Затем сорбент промывают 2,5 л 0,5% раствора сульфата аммония. Время промывки 1 ч. Элюцию цитохрома C проводят 10% раствором сульфата аммония с pH 9,6 (pH устанавливают добавкой 1 н. раствора NH₄OH). Скорость подачи элюирующего раствора 240 мл/ч. Время элюции 5,5 ч. Элюат отбирают фракциями. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют. Объем таких фракций 770 мл при показателе чистоты цитохрома C 0,58. Объединенные фракции подкисляют 20% раствором серной кислоты до pH 7,5. В элюат порциями добавляют безводный порошкообразный сульфат аммония и смесь перемешивают до полного растворения очередной порции. Количество сульфата аммония составляет 0,5 г/мл элюата или 385 г. Выпавший аморфный осадок балластных белков отфильтровывают и определяют показатель чистоты цитохрома C. На этой стадии он составляет 0,80. К фильтрату при охлаждении до 5^oC добавляют 20 мл 20% водного раствора трихлоруксусной кислоты, то есть 25 мл/л раствора, при перемешивании. Раствор выдерживают при той же температуре 15 мин. Центрифугированием отделяют надосадочную жидкость. Осадок суспендируют в 10 мл насыщенного раствора сульфата аммония и вторично центрифугируют. Осадок растворяют в минимальном количестве воды (25 мл) и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного отделения иона SO2-4

Примеры 3 11 выполнены в условиях примера 2.

Все экспериментальные данные представлены в табл. 1. При этом в табл. 1
4 индекс K₁ означает сорбент, полученный по примеру 1, К₂ - сорбент на основе сополимера акриловой кислоты с дивинилбензолом.

Дополнительно определяют значения предельной емкости сорбции и обратимости сорбции на чистом цитохроме C в условиях максимальной емкости на катионитах в Na⁺-форме. Данные представлены в табл. 2.

Определяют также значения предельной емкости катионитов по цитохрому C в зависимости от ионной силы раствора. Данные представлены в табл. 3.

Предварительными модельными опытами были найдены pH-зависимость сорбции цитохрома C на карбоксильных катионитах K₁ и K₂. Данные представлены в табл. 4.

Таким образом, наибольшая емкость по цитохрому C достигается при pH 5,0 на K₂ и при pH 6,2 на катионите K₁. Проведенные исследования показали, что при сорбции из экстракта с pH 6,8 7,4 снижаются абсолютные количества сорбируемого цитохрома C, но существенно увеличиваются относительные его количества по отношению к сорбируемым той же смолой кислым балластным белкам, что значительно увеличивает селективность сорбции.

Регенерацию сорбентов, используемых в данном способе, проводят после завершения элюции. Сорбент сначала промывают водой (5 8 объемов колонки), затем 1 н. раствором соляной кислоты (до pH 1,8 на выходе колонки), после чего сорбент обрабатывают 1 н. раствором едкого натра (до pH 11,0 на выходе колонки) и промывают водой до pH 7,0 8,5.

Источники информации
1. F. Okumura and al J. Chem. Soc. Japan, v. 49, N 1, p. 65, 1975.

B. Hagihara and al. J. Biochem, v. 45, N 8, p. 551, 1958.

3. А. А. Лурье. Сорбенты и хроматографические носители. М. Химия, 1972, с. 32.

4. S. Palus. J.B. Neilands. Acta Chem. Scand. v. 4, p. 1024, 1950.

5. E. Margoliash. Biochem. J. v. 56, p. 529, 535, 1954.

6. Справочник. Ионообменные материалы для процессов гидрометаллургии, очистки сточных вод и водоподготовки. Ред. Ласкорин Б.Н. изд. 3. М. ВНИХТ, 1983, с. 37.

7. Е.И. Гринькова, А.Т. Меленевский, К.П. Папукова, Е.Б. Чижова. Исследование взаимодействия цитохрома C с различными формами карбоксильного катионита КМД. Журнал прикладной химии, т. 65, N 4, 1992, с. 939 942.

Использование: изобретение относится к химии биологически активных веществ белковой природы, более точно к выделению цитохрома C из мышц сердца крупного рогатого скота. Сущность изобретения: цитохром C получают обезжириванием сердец крупного рогатого скота, удалением из них связок, сосудов, измельчением и отмыванием крови. Полученный фарш экстрагируют водным раствором сильной кислоты - 0,10 - 0,15% серной или 2,0 - 2,5% трихлоруксусной при 10 - 15^oC и при pH 3,9 - 4,2. Экстракт после отделения от фарша подщелачивают до pH 6,8 - 7,4 и непосредственно из него ведут сорбцию целевого продукта на карбоксильном катионите, представляющем собой полимер из ряда, включающего сополимер метакриловой кислоты N,N'- гексаметилендиметакриламидом и сополимер акриловой кислоты с дивинилбензолом, катионит используют в Na⁺-форме. Элюцию проводят 10 - 12%-ным раствором сульфата аммония с pH 9,0 - 9,8, из элюата при pH 7,2 - 7,5 осаждают балластные белки добавкой сульфата аммония в количестве 0,5 г/мл элюата, из надосадочной жидкости осаждают цитохром C действием 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты при охлаждении. Выпавший осадок растворяют в малом количестве воды и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления иона SO2-4

1. Способ получения цитохрома С, включающий обезжиривание сердец крупного рогатого скота, удаление из них связок и сосудов, измельчение и отмывку от крови, экстракцию измельченного сырья кислотным раствором, осаждение балластных белков сульфатом аммония, сорбцию и элюцию на карбоксильных катионитах, осаждение целевого продукта трихлоруксусной кислотой при охлаждении, очистку его диализом, отличающийся тем, что экстракцию проводят водным раствором сильной кислоты при 10 15^oС и pH 3,9 4,2, полученный экстракт отделяют от фарша, подщелачивают его до pH 6,8 7,4 и сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из экстракта на карбоксильном катионите, представляющем собой полимер из ряда, включающего сополимер метакриловой кислоты с N, N'-гексаметилендиметакриламидом и сополимер акриловой кислоты с дивинилбензолом в Na⁺-форме, элюцию проводят 10 12%-ным раствором сульфата аммония с pH 9,0 9,8, осаждение балластных белков осуществляют после стадии элюции, при этом сульфат аммония добавляют в количестве 0,5 г на 1 мл элюата при pH 7,2 7,5, а осаждение целевого продукта осуществляют из полученной надосадочной жидкости с использованием 20%-ного водного раствора трихлоруксусной кислоты, осажденный цитохром С растворяют в воде и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления ионов SO2-4