ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭШЕРИХИЙ С ПЕРСИСТЕНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/10 C12N1/20 C12R1/19 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, гигиене и санитарии, в частности к питательным средам для выделения эшерихий.

Феномен персистенции эшерихий используется в клинике для решения вопросов диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, а также с целью прогнозирования течения и рациональной терапии заболеваний (Бухарин О.В. Персистенция бактерий. Актовая речь. Оренбург. 1992). Персистентные свойства эшерихий используются для характеристики санитарно-бактериологического состояния водоемов (Гриценко В.А., Бухарин О.В. Характеристика микробиоценоза и оценка биопрофиля эшерихий как элементы микробиологического мониторинга гидросферы. /Тез. докл. международной конф. "Загрязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии". /Пермь, 1993, с. 38 - 39) в связи с тем, что в условиях повышенного антропогенного и техногенного загрязнения окружающей среды уменьшается биоиндикационная значимость санитарно-показательных микроорганизмов. Происходит снижение количественного содержания кишечной палочки за счет ее гибели под воздействием токсикантов (Виноградова Л.А., Пархомчук Т. К. Комплексные санитарно-гигиенические критерии оценки качества водных объектов в условиях возрастающей антропогенной нагрузки. Гиг. и сан., 1991, N1, с. 24 - 26) на фоне повышения у нее персистентных характеристик (Бухарин О. В. , Дерябин Д.Г., Гриценко В.А. Анализ персистентных характеристик бактериальных популяций как основа микробиологического мониторинга природных экосистем. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия". Оренбург, 1991, с. 17 - 18).

Одним из факторов, обеспечивающих персистирование микробной клетки, является антиинтерфероновый признак, характеризующий способность эшерихий инактивировать бактерицидную фракцию системы человеческого лейкоцитарного интерферона. Экспериментально-клинические материалы свидетельствуют, что антиинтерфероновая активность (АИА) определяет вирулентные и иммуно-супрессивные свойства микроорганизмов, обусловливает более длительное и тяжелое течение заболеваний с присоединением осложнений, характерных для иммунодефицитных состояний. Определение антиинтерферонового признака у эшерихий нашло широкое применение в клинико-лабораторной практике для оценки степени тяжести инфекционного процесса (а.с. N 1644911. Способ прогнозирования осложнений пиелонефрита. Бухарин О.В., Зыкова Л.С., Соколов В.Ю., Челпаченко О.Е. Открытия, 1992, N 16). Преимущественное обнаружение микроорганизмов, обладающих антиинтерфероновой активностью при различных патологических состояниях (Соколов В. Ю. Антиинтерфероновая активность микроорганизмов. Персистенция бактерий. Сб. научн. трудов. Куйбышев, 1990, с. 83 - 92), определяет интерес клиницистов и эпидемиологов к поиску антиинтерферонактивных эшерихий как в организме человека, так и во внешней среде.

На сегодняшний день бактериологический метод является единственным используемым для выделения эшерихий из исследуемого материала и осуществляется в соответствии с общепринятой методикой (Энтеробактерии. Руководство для врачей. Под руководством В.И. Покровского. М., 1985). Определение АИА осуществляется чашечным методом на основе феномена "отсроченного антагонизма" (а.с. N 156491. Способ определения антиинтерфероновой активности микроорганизмов. Бухарин О.В., Соколов В.Ю. Открытия, 1990, N 18), а также ускоренным методом (Соколов В. Ю. , Тарасевич А.В. Ускоренный метод определения антиинтерфероновой активности бактерий. ЖМЭИ, 1992, N 11 - 12, с. 10 - 11). Изучение АИА у эшерихий достаточно трудоемко, длительно по времени (от 3 до 5 сут.), требует большого количества питательных сред, лабораторной посуды, специальных ингредиентов, тест-штамма, что затрудняет определение этого признака у культур при массовых исследованиях. Это связано с отсутствием специальной питательной среды для селекции эшерихий с указанным признаком.

Известен ряд питательных сред, которые используются в бактериологической практике для выделения и дифференциации эшерихий - Эндо, Левина и др. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под редакцией М. О. Биргера. М., 1982). Однако ни одна из них не дает возможности избирательно выделять эшерихии, обладающие АИА.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является выбранная в качестве прототипа питательная среда Эндо для выделения и дифференциальной диагностики эшерихий, содержащая обычный питательный агар, чистую лактозу, спиртовой раствор основного фуксина и водный раствор сульфита натрия, выпускаемая в сухом виде в качестве официнального препарата (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под редакцией М.О. Биргера. М., 1973). Недостатком этой среды является невозможность избирательного выделения только эшерихий с АИА.

Характеристика среды-прототипа с указанием причины, препятствующей получению требуемого технического результата, дает основание сделать вывод о том, что заявляемое изобретение не известно из уровня техники, т.е. является новым.

Существенные отличия заключаются в том, что заявляемая питательная среда содержит одним из компонентов антибиотик класса полусинтетических пенициллинов, позволяющий селекционировать эшерихии, обладающие АИА. Существенное отличие является новым и дает возможность осуществлять в более короткие сроки выделение антиинтерферонактивных эшерихий. Заявляемая среда может быть использована для массовых скрининг-исследований в клинике и при проведении санитарно-бактериологических обследований воды.

Предлагаемая среда конструируется на основе известной питательной среды Эндо, в которую согласно формуле изобретения дополнительно вводят в качестве селективного агента раствор антибиотика карбенициллина на изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1•10^-2 - 1•10^-3 г/мл в количестве 10 - 12 мас.%.

Питательную среду готовят следующим образом: первоначально готовят среду Эндо согласно инструкции. Приготовленную среду охлаждают до 50 - 60^oC. В это время стерильно готовят разведение антибиотика карбенициллина в концентрации 1•10^-2 - 1•10^-3 г/мл на изотоническом растворе хлорида натрия. Карбенициллин выпускается официнально во флаконах по 1 г сухого вещества. К 100 мас. ч. приготовленной и охлажденной среды Эндо добавляют 11 - 13 мас. ч. приготовленного раствора антибиотика и перемешивают. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и оставляют до полного застывания. Чашки со средой используются сразу же в опыте или могут храниться в условиях холодильника не более 24 ч. При проведении исследования на поверхность полученной питательной среды засевают пятачками суточные агаровые культуры выделенных эшерихий либо производят посев исследуемого материала согласно общепринятым методикам. Результаты учитывают через 24 ч инкубации в термостате при 37^oC. Исследованиями установлено, что введение в состав питательной среды Эндо карбенициллина способствует избирательному росту антиинтерферонактивных эшерихий. Таким образом, выросшие на предлагаемой среде эшерихии считаются антиинтерферонактивными.

Теоретической предпосылкой для разработки предлагаемой среды послужили обнаруженные нами различия в действии антибиотиков на эшерихии, обладающие и не обладающие антиинтерфероновой активностью. Данные представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, карбенициллин - антибиотик широкого спектра действия, относящийся к классу полусинтетических пенициллинов, подавляет рост практически всех эшерихий, не обладающих исследуемым признаком (98,5%), в то время как антиинтерферонактивные штаммы резистентны к данному антибиотику не менее чем в 76% случаев. Это явление, по всей вероятности, объясняется следствием детерминирования АИА и резистентности к карбенициллину единой или конъюгативной плазмидой. Подтверждением данного предположения может служить установленная способность карбенициллина стимулировать АИА у эшерихий, устойчивых к этому препарату (Челпаченко О.Е. Экспериментальное обоснование рациональной терапии пиелонефрита у детей под контролем маркеров персистенции возбудителя. Автореф. канд. дисс. Челябинск, 1993). Достаточно большое число штаммов антиинтерферонактивных эшерихий растет в присутствии тетрациклина и стрептомицина, тем не менее наличие определенного процента культур, не активных по исследуемому признаку и устойчивых к этим препаратам, делает неприемлемым их использование с целью селективного выделения антиинтерферонактивных эшерихий. Представленные в табл. 1 данные по действию на исследуемые штаммы полимиксина, эритромицина, левомицетина, ампициллина и канамицина также свидетельствуют о невозможности их использования с указанной целью. Таким образом, карбенициллин предлагается нами в качестве селективного компонента в заявляемой среде, позволяющей при ее использовании выделять не менее 76% антиинтерферонактивных эшерихий от общего количества активных штаммов, содержащихся в исследуемом материале.

Экспериментальным обоснованием дозы антибиотика, используемой в заявляемой среде, явились результаты серии опытов, в которых показано, что из расчета на 100 мл готовой среды Эндо 11 - 13 мл раствора антибиотика на изотоническом растворе хлорида натрия концентрации 1•10^-2 - 1•10^-3 г/мл является оптимальным количеством, необходимым для селективного роста антиинтерферонактивных эшерихий. При этом введение в среду раствора карбенициллина в концентрациях, больших чем 1•10^-2 г/мл, и в количестве более 13 мл подавляет рост всех изучаемых штаммов, а в концентрации, меньшей чем 1•10^-3 г/мл, и в количестве менее 11 мл не препятствует росту дифференцируемых штаммов. Результаты опытов приведены в табл. 2.

Были проведены клинико-лабораторные исследования заявляемой среды.

Пример 1.

Были приготовлены две питательные среды: одна согласно прототипу, вторая согласно формуле изобретения. На поверхность обеих сред были засеяны пятачками суточные агаровые культуры /30/ эшерихий, выделенных из исследуемого материала от больных с различной патологией и из воды поверхностных водоемов, с целью обнаружения у них антиинтерферонового признака. Результаты учитывали через 24 ч инкубации в термостате при 37^oC. Наличие у исследуемых культур АИА подтверждалось в дальнейшем результатами чашечного метода определения АИА. Данные опыта представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, на среде-прототипе выросло почти в три раза больше культур, чем на заявляемой среде, из которых лишь у 40% штаммов антиинтерфероновая активность была подтверждена чашечным методом, в то время как на предлагаемой среде из 12 выросших культур все 12 /100%/ были антиинтерферонактивными.

Пример 2.

Больная К., 8 лет. Диагноз: Хронический пиелонефрит в стадии обострения. Было проведено исследование мочи с целью обнаружения антиинтерфероновых эшерихий. Равные количества мочи в разведении 1•10^-4 были засеяны на поверхность среды-прототипа и предлагаемой среды. Результаты учитывали через 24 ч инкубации при 37^oC. Наличие у выросших колоний эшерихий антиинтерфероновой активности подтверждалось в дальнейшем результатами чашечного метода. Данные исследования представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, предлагаемая среда позволяет с большей эффективностью вести поиск антиинтерфероновых эшерихий в исследуемом материале.

Пример 3.

Были проведены исследования пробы речной воды с целью выявления в ней антиинтерферонактивных эшерихий. После фильтрования 1 л воды мембранные фильтры были помещены на чашки Петри со средой-прототипом и предлагаемой средой. Результаты учитывались после 24 ч инкубации в термостате при 37^oC. Данные проведенного исследования представлены в табл. 5.

Как видно из результатов, представленных в табл. 5, эффективность выделения антиинтерферонактивных эшерихий из воды значительно выше при использовании предлагаемой среды.

Таким образом, применение предлагаемой питательной среды дает возможность избирательно выделять эшерихии, обладающие антиинтерфероновой активностью. При этом сокращаются сроки проведения микробиологических исследований, что обосновывает практическую ценность и экономическую эффективность ее использования при массовых скрининг-обследованиях как в клинической, так и в санитарно-гигиенической практике.

Компоненты питательной среды доступны, предлагаемая питательная среда легко может быть приготовлена в любой микробиологической лаборатории.

Питательная среда предназначена для использования в клинике при решении вопросов дифференциальной диагностики, а также в санитарно-гигиенической практике при бактериологических исследованиях объектов водопользования. Среда содержит питательную основу - среду Эндо, селективный агент - антибиотик карбенициллин из класса полусинтетических пенициллинов в изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1 • 10^-2 - 1 • 10^-3 г/мл и воду дистиллированную. Среда позволяет избирательно выделять эшерихии, обладающие свойством персистенции и антиинтерфероновой активностью. 5 табл.

Питательная среда для выделения эшерихий с персистентными свойствами на основе Эндо, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит селективный агент - антибиотик из класса полусинтетических пенициллинов карбенициллин в изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1 • 10^-2 и 1 • 10^-3 г/мл при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Среда Эндо (порошок) - 3,0
Карбенициллин в изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 1• 10^-2 и 1 • 10^-3 - 10 - 12
Вода дистиллированная - Остальноез