СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ Российский патент 2004 года по МПК A61K38/00 A61P31/06 

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лечения туберкулеза легких.

Известно, что протективный эффект при развитии туберкулезной инфекции обеспечивают цитокины, вырабатываемые Тхелперами-1 (ТХ-1) - гамма-интерферон (ИФН-γ), интерлейкин-2 (ИЛ-2) и ИЛ-12, которые являются медиаторами клеточно-опосредованного иммунитета (1, 2, 3). При активной прогрессирующей инфекции обнаружен высокий уровень продукции ИЛ-4, снижение синтеза ИЛ-2 стимулированными клетками, нарушение экспрессии рецептора к ИЛ-2 у активированных лимфоцитов, снижение пролиферативного ответа лимфоцитов на ИЛ-2. Все это свидетельствует о стимуляции Т-2 хелперной субпопуляции лимфоцитов (ТХ-2), расцениваемой в последнее время как показатель снижения сопротивляемости к туберкулезу, и о снижении активности CД4⁺TX-1.

Используемые в комплексном лечении туберкулеза в качестве иммуномодуляторов полипептиды тимуса (тималин, тимазин, тимоген) способны воздействовать на уровень ТХ-1 цитокинов, однако при этом активируют практически все субпопуляции лимфоцитов, в том числе ТХ-2, что может снизить эффективность иммунного ответа на МБТ.

Представители нового класса иммунокорректоров - рекомбинантные интерлейкины (рИЛ-): рИЛ-2, рИФН-γ действуют на ТХ-1 по аутокринному механизму (клетка, которая секретирует цитокин, им же и активируется).

Первые работы по использованию в терапии туберкулеза рИЛ-2 и рИФН-γ показали выраженный иммунокорригирующий эффект препаратов (4, 5, 6, 7). Значительный лечебный эффект рИЛ-2 - ронколейкина (прототип) при быстро прогрессирующем экспериментальном туберкулезе с выраженным деструктивным компонентом воспаления (8) послужил обоснованием к его успешному использованию в клинике СПбНИИФ (9).

Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности лечения больных туберкулезом легких путем использования в его комплексной терапии синтетического пептидного соединения бестима.

Результаты изучения биологической активности бестима показали, что он усиливал созревание ТХ (экспрессию антигена L3T4), продукцию ИЛ-2 и экспрессию рецептора ИЛ-2 (9). Перед рИЛ, в том числе перед ронколейкином, бестим обладает рядом преимуществ: активен при внутримышечном введении, не содержит эндотоксинов и неиммуногенен, а следовательно, гораздо лучше переносится пациентами, имеет значительно более низкую себестоимость.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Влияние бестима на течение экспериментальной туберкулезной инфекции.

Исследования проведены на 465 беспородных белых мышах-самцах на модели генерализованного туберкулеза, полученной при внутривенном заражении животных культурой штамма М. bovis 8 (0,1 мг) разной степени вирулентности, что позволило получить отличающиеся по степени тяжести и темпу прогрессирования формы экспериментального туберкулеза (быстропрогрессирущую с выраженным деструктивным компонентом, средней тяжести течения и вялотекущую). Лечение мышей начинали с 8-го дня, а при вялотекущей форме - с 12-го дня после заражения при обнаружении в легких многочисленных субмилиарных либо единичных милиарных очагов. Бестим применяли в дозах 0,25 мкг/мышь; 0,2; 2,0 и 20,0 нг/мышь внутрибрюшинно, 5 инъекций в двух режимах: ежедневно и 1 раз в три дня на фоне туберкулостатика (изониазид, 10 мг/кг). Исследован также режим с повторением курса бестима (20 нг/мышь, в/бр) после двух дней перерыва (всего 10 инъекций). Эффективность лечения регистрировали по результатам биометрических, гистологических и бактериологических исследований. Функциональную активность макрофагов оценивали по уровню внеклеточной 5-нуклеотидазы в первичной культуре перитонеальных макрофагов (пМф) (10). Фагоцитоз макрофагов исследовали на пластиковых одноразовых чашках Петри в отношении клеточной взвеси дрожжей рода Sacch. cerevisiae (1×10⁷), опсонизированных сывороткой мышей. Продукцию ИЛ-2 (спонтанную и индуцированную Кон А 5 мкг/мл) определяли в первичных культурах спленоцитов по уровню пролиферации ИЛ-2 зависимой клеточной линии CTLL (11).

Результаты экспериментов показали, что бестим проявляет максимальный терапевтический эффект при тяжелом быстропрогрессирующем туберкулезе (начало гибели - через 2 недели после заражения). При этом у животных, получавших препарат в оптимальной дозе (20 нг/мышь, 5 инъекций ежедневно), его действие отмечено уже сразу после окончания курса, а через 3 недели, на момент завершения опыта, отмечались: положительная динамика массы (1,62% против 9,49% в группе контроля лечения), 100% выживаемость (у мышей, леченных изониазидом - 75%, Р<0,05), значимое снижение индекса поражения легких (2,65 усл.ед. против 3,24 усл.ед. у контроля лечения, Р<0,05). Гистологическое исследование подтвердило лечебное действие этой дозы препарата. У мышей, леченных бестимом в оптимальной дозе, отмечена самая высокая воздушность легочной ткани (37,38% против 15,54%, Р<0,001). В очагах специфического воспаления, представленного у мышей участками альвеолярно-макрофагального грануломатоза, значительно снизилась встречаемость скоплений нейтрофильных гранулоцитов (75% против 100%, Р<0,05), не обнаружено скоплений ядерного детрита (0% против 66,7%, Р=0,01) и участков некроза. Чаще, чем в группе контроля лечения, встречаются у этих мышей крупные периваскулярные (87,5 против 50%) и перибронхиальные (62,5 против 0%, Р<0,02) инфильтраты, а также скопления пенистых макрофагов (87,5 против 16,7%, Р<0,01), что свидетельствует о напряженности местного иммунитета легочной ткани. Исследование индуцированной Кон А продукции ИЛ-2 спленоцитами (фиг.1) показало, что бестим значительно (Р<0,001), в 2,5-3 раза по сравнению с группой контроля лечения, активизирует секрецию ИЛ-2, практически ингибированную у зараженных нелеченных животных с тяжелой быстропрогрессирующей формой течения туберкулеза.

При оценке функционального состояния перитонеальных макрофагов (по активности внеклеточной 5-нуклеотидазы, снижение которой является биохимическим критерием стимуляции макрофагов) выявлено, что лечение мышей туберкулостатиком (изониазид) привело через 4 недели терапии к увеличению показателя с 2,58±0,28 усл.ед. (интактная группа) до 3,95±0,44 усл.ед. (Р<0,05), что свидетельствует об угнетении активности клеток. Присоединение к изониазиду бестима способствовало значимому снижению уровня активности фермента (до 2,03±0,26 усл.ед., Р<0,01), сопоставимому по степени выраженности с эффектом ронколейкина (2,08±0,32 усл.ед., фиг.2), что позволяет утверждать о нормализации препаратом функциональной активности макрофагов.

Заражение мышей культурой МБТ средней вирулентности привело к развитию стандартно протекающего варианта течения инфекции, при котором начало гибели животных регистрировали значительно позже - через 3 недели после заражения. Бестим при этом заметно менее выраженно влиял на характер течения инфекции. Из показателей тяжести течения процесса достоверно изменился под действием проводимой терапии лишь индекс поражения легких. Следует отметить достоверное снижение пораженности легочной ткани как при использовании бестима в дозах 20 и 250 нг/мышь, показавших высокую эффективность в предыдущем опыте, так и при применении 2 нг/мышь препарата. При гистологическом исследовании не наблюдали значимого влияния бестима на характер специфического поражения, что возможно связано с меньшей распространенностью патологического процесса и снижением деструктивного компонента воспаления при использовании штамма МБТ средней вирулентности.

Динамика торможения продукции ИЛ-2 в ответ на Кон А спленоцитами зараженных мышей (фиг.3) носила в этом опыте несколько иной характер, чем при использовании культуры М. bovis высокой вирулентности. Через 2 недели после заражения степень угнетения выработки цитокина соответствовала таковой в предыдущем опыте. Однако на следующих сроках наблюдения, через 3 и 4 недели после заражения, отмечалось некоторое восстановление продукции ИЛ-2 в ответ на митоген (примерно до уровня 50% от синтеза цитокина в интактной группе). Видимо вследствие этого сгладились и различия между группами контроля заражения и лечения (изониазид), отмечавшиеся через 2 недели после заражения. Введение в терапию бестима значимо отразилось на продукции цитокина. Наибольшая стимуляция синтеза ИЛ-2 наблюдалась сразу после окончания курса бестима в дозах 250 и 20 нг/мышь (26,2±2,2 ед/мл и 26,9±2,8 ед/мл против 9,9±0,3 ед/мл у мышей, леченных только изониазидом, Р<0,001). При этом уровень продукции ИЛ-2 у опытных животных поднялся более чем до 70% от величин у незараженных мышей. Эффект препарата отмечали и через неделю после окончания его курса. Синтез ИЛ-2 сохранялся на том же уровне - 70% от показателя интактной группы (126,5±2,4 ед/мл и 125,3±19,3 ед/мл против 102,2±2,6 ед/мл у мышей контроля лечения). На этом сроке наблюдали повышение продукции цитокина и у мышей, получавших бестим в дозе 2 нг/мышь.

Использование бестима при вялотекущей инфекции также привело к повышению эффективности этиотропной терапии. Действие препарата (по снижению коэффициента массы селезенки и индексу поражения легких) отмечено уже через 4 дня после окончания его курса и наиболее отчетливо зарегистрировано через 3,5 недели после отмены препарата. Оптимальным при данной форме течения инфекции было применение бестима в дозе 2 нг/мышь.

При данной форме процесса, как и при вышеописанных, обнаружена достоверная ингибиция продукции ИЛ-2 (27,5±3,6 ед/мл против 75,6±4,5 ед/мл у интактных мышей, Р<0,001). Бестим при лечении мышей оптимальной дозой препарата значительно повышал секрецию ИЛ-2 при сравнении с группой контроля лечения на всех сроках наблюдения, начиная с 4-го дня после отмены препарата (41,6±4,0 ед/мл против 16,6±2,0 ед/мл, Р<0,05).

Исследование фагоцитоза клеточной взвеси дрожжей на первом сроке наблюдения (через 4 дня после окончания курса препарата) выявило у зараженных нелеченных мышей с вялотекущим туберкулезом угнетение как поглотительной (фагоцитарная активность, фагоциторное число), так и переваривающей (показатель завершенности фагоцитоза) функций перитонеальных макрофагов (пМф). Степень ингибиции показателей на 28-й день после заражения была довольно значительной: фагоцитарная активность снизилась в 14 раз (4,6 против 64,2% у интактных мышей, Р<0,01), фагоцитарное число - в 2,1 раза (3,89 усл.ед. против 8,15 усл.ед., Р<0,05), показатель завершенности фагоцитоза - в 13,6 раза (14,4 усл.ед. против 196,4 усл.ед., Р<0,01). Монотерапия изониазидом привела к некоторому увеличению показателей, но не до уровня интактных животных (Р<0,01; Р=0,05; Р<0,05). Присоединение к туберкулостатику бестима вызвало дальнейшее увеличение фагоцитоза. У мышей, получавших оптимальную дозу препарата (2 нг/мышь), значимо повысилась фагоцитарная активность (38,8 усл.ед. против 19,4 усл.ед. у контроля лечения, Р<0,05), нормализовалось фагоцитарное число, существенно увеличился показатель завершенности фагоцитоза (244,2 усл.ед. против 196,4 усл.ед., Р<0,05), появилась тенденция к увеличению индекса завершенности фагоцитоза (2,5 усл.ед. против 1,5 усл.ед.). Через 3,5 недели после отмены препарата у мышей, леченных изониазидом, зарегистрировано снижение переваривающей функции макрофагов (показатель завершенности фагоцитоза - 62,0 усл.ед. против 178,0 усл.ед. у интактных мышей, Р=0,05), возможно связанное с иммунодепрессивным компонентом действия туберкулостатика, проявляющимся при длительном его использовании. Присоединение бестима привело к достоверному повышению показателя (215,0 усл.ед., Р<0,05).

Проведено сопоставление эффектов бестима и рИЛ-2 - ронколейкина, успешно апробированного нами ранее в лечении тяжелых форм экспериментального туберкулеза с выраженным деструктивным компонентом воспаления. Обнаружено, что влияние бестима на показатели тяжести течения остропрогрессирующей инфекции отмечено на 2 недели раньше и к моменту окончания опыта по большему числу показателей. Так, у мышей, получавших бестим, отмечена большая выживаемость, лучшая динамика массы тела, наименьшая выраженность альтеративного компонента воспаления при гистологическом исследовании и наибольшая воздушность легочной ткани. При этом оптимальная доза бестима была в 10000 раз меньше таковой у ронколейкина (250 мкг/мышь). Действие обоих препаратов на продукцию ИЛ-2 спленоцитами носило близкий характер и по срокам стимуляции, и по ее уровню (фиг.1).

В опыте, где была использована культура МБТ средней вирулентности, не отмечено различий в действии препаратов на характер течения процесса. Однако у бестима в отличие от ронколейкина зарегистрировано стимулирующее влияние на секрецию ИЛ-2 (фиг.3).

При вялотекущем экспериментальном туберкулезе, при котором назначение ронколейкина не отразилось на развитии инфекции, бестим существенно снизил тяжесть ее течения, активировал продукцию ИЛ-2 на Кон А, поглотительную и переваривающую функцию перитонеальных макрофагов при их угнетении.

Обнаруженные различия между ронколейкином и бестимом в сроках проявления и выраженности лечебного эффекта при различных вариантах течения инфекции, по-видимому, можно связать с действием препарата на ТХ-1. Кроме аналогичного ронколейкину непосредственного влияния на экспрессию ИЛ-2 рецепторов, бестим оказывает стимулирующее действие на пролиферацию ТХ-1, значительно подавленную при данном течении процесса.

Рост популяции ТХ-1 способствует наряду с увеличением уровня ИЛ-2 повышению уровня ИФН-γ (стимулятора антигенпрезентирующих клеток), а также активации цитотоксического потенциала СД4⁺ и NK лимфоцитов.

Таким образом, бестим существенно повышал эффективность этиотропной терапии при всех исследованных вариантах течения генерализованного туберкулеза у мышей (остропрогрессирующем, стандартно-протекающем и вялотекущем). Параллельно повышению результативности лечения при использовании бестима наблюдалось увеличение функциональной активности макрофагов и стимуляция продукции ИЛ-2 в ответ на Кон А спленоцитами. Наибольшую терапевтическую активность бестим проявляет при тяжелых, прогрессирующих формах туберкулезной инфекции с выраженным деструктивным компонентом воспаления.

В клинических условиях способ лечения осуществляется следующим образом.

1. Препарат вводится внутримышечно в дозе 0,1 мг.

2. В качестве растворителя используется 0,9% раствор хлорида натрия в количестве 1,0 мл.

3. Препарат вводится ежедневно, курс лечения 5 инъекций.

4. Бестим назначается на фоне применения противотуберкулезных препаратов.

Эффективность лечения оценивали по общепринятым критериям: ликвидация симптомов интоксикации и локальных проявлений болезни, улучшение местного процесса в рентгенологическом отображении (рассасывание воспалительных и инфильтративных формирований, уменьшение или закрытие полостей распада), прекращение бактериовыделения. Параллельно изучался иммунный статус: по реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) на специфический митоген - туберкулин (ППД) и митоген фитогемагглютинин (ФГА), количеству СД₃, СД₄, СД₈, а также по серологическим реакциям с туберкулезным митогеном: реакции потребления комплемента (РПК), реакции пассивного гемолиза (РПГ) и методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Примеры клинического использования

Пример 1. Больной У. 1962 г. рождения. И.Б. №189/172. Поступил в клинику 07 апреля 2000 года. Клинический диагноз: инфильтративный туберкулез в верхней доле и С₆ правого, и С₄, С₅ левого легких в фазе распада и обсеменения. МБТ (+). У больного выявлены симптомы интоксикации, локальные признаки болезни (изменение дыхания, катаральные явления над долей поражения). На рентгенограммах и томограммах грудной клетки в верхней доли правого легкого на фоне инфильтративных изменений определялись множественные специфические полости распада, в С₆ - крупные очаги обсеменения с перифокальной реакцией, неоднородные по структуре за счет расплавления казеозных масс. В язычковых сегментах левого легкого также выявлялись скопления крупных очагов, окруженных перифокальным воспалением и включающих зоны расплавления легочной ткани. В клиническом анализе крови - лейкоцитоз - 11,4×10⁹, ускоренная СОЭ - 36 мм/ч. При иммунологическом исследовании установлено снижение количества СД4+, СД8+ лимфоцитов, уменьшение РБТЛ с ФГА и отрицательный специфический клеточный ответ (РБТЛ с ППД).

На фоне двухмесячной терапии отмечено некоторое уменьшение симптомов интоксикации, однако у больного сохранялись множественные сгруппированные полости распада на фоне сниженных показателей клеточного иммунитета (абсолютного количества Т-лимфоцитов, РБТЛ на ФГА, числа Т-лимфоцитов с фенотипом СД+8

Больному назначен бестим 0,1 мг внутримышечно ежедневно №5 на фоне продолжающейся химиотерапии: Н (изониазид) - внутривенно капельно 600 мг/сутки, Z (пиразинамид) - per os 1500 мг/сутки, R (рифампицин) - 450 мг/сутки per os, К (канамицин) - внутримышечно 1000 мг/сутки.

В результате лечения наряду с клинико-рентгенологическим улучшением (абациллирование, закрытие полостей распада, рассасывание очаговых изменений) установлено увеличение абсолютного количества Т-лимфоцитов с 1011,4 кл. до 1441,8 кл.; повышение функциональной активности Т-лимфоцитов по РБТЛ на ФГА с 29,0 до 40% (N-50%); нормализация числа СД+8

Пример 2. Больная М. 1955 г. рожд. И.Б. 239. Поступила в клинику 29 мая 2000 года. Диагноз: инфильтративный туберкулез в верхней доле левого легкого в фазе распада и обсеменения МБТ (+). Специфический процесс был выявлен в апреле 1999 года. В мае 2000 г. на фоне амбулаторного лечения зарегистрировано прогрессирование.

При поступлении симптомы интоксикации выражены умеренно, в клиническом анализе крови отмечались лимфопения (18%) и ускорение СОЭ (25 мм/ч). Выявлено бактериовыделение с устойчивостью МБТ к S (стрептомицин), к низкой концентрации Н и к сочетанию S+H. При иммунологическом обследовании отмечено снижение количества Т-лимфоцитов (СД₃+ 713,4 кл.). На рентгенограммах и томограммах в аксиллярном сегменте левого легкого определялся специфический инфильтрат с пневмониогенной полостью распада, очагами обсеменения вокруг, широкой воспалительной дорожкой к корню. Сопутствующая паталогия: хронический бронхит, хронический гастрит, эрозивный бульбит, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, полиаллергоз. Пациентке проводилась интенсивная химиотерапия: Н - внутривенно капельно 600 мг/сутки, К - внутримышечно 1000 мг/сутки, Z - per os 1500 мг/сутки, R - per os 450 мг/сутки.

На фоне отсутствия положительной динамики проведен курс бестима (0,1 мг ежедневно внутримышечно, 5 инъекций). В результате через 1 месяц лечения у больной установлена выраженная положительная клинико-рентгенологическая динамика специфического процесса (купирование симптомов интоксикации, абациллирование, рассасывание воспалительных изменений части очаговых формирований, ликвидация полостей распада). Также нормализовались показатели лимфоцитов и значительно улучшилась переносимость препаратов, уменьшилось до нормы исходно высокое содержание ЦИК с 84 до 69 усл.ед. (N - 22-66 усл.ед.), не изменились исходно нормальные показатели клеточного иммунитета. Рентгенологически зафиксировано уменьшение размеров и заполнение полости распада, рассасывание экссудативных очагов обсеменения.

Таким образом, в обоих описанных случаях бестим на фоне продолжающейся химиотерапии проявил выраженный терапевтический эффект, способствуя заживлению полостей распада и рассасыванию очагов специфического воспаления. Иммуномодулирующая активность препарата проявилась в стимуляции клеточного звена иммунного ответа при его угнетении и нормализации повышенного аллергического фона.

Данные по экспериментальному исследованию эффективности бестима и механизма его иммунокорригирующего эффекта и примеры клинического применения препарата свидетельствуют о перспективности использования этого синтетического полипептида во фтизиатрии, что позволит улучшить результаты лечения и сократить сроки пребывания больных в стационаре на 1,5-2 месяца. Реализация терапевтического эффекта бестима, по-видимому, осуществляется за счет увеличения угнетенной при развитии туберкулезной инфекции функциональной активности Th-1.

Бестим при его использовании в терапии генерализованного туберкулеза у мышей выгодно отличается от ронколейкина по следующим параметрам: выраженность и сроки проявления лечебного эффекта; оптимальная доза, на порядок меньшая таковой у ронколейкина; возможность использования при различных вариантах течения инфекции. К числу других преимуществ бестима относятся: активность при внутримышечном введении, отсутствие эндотоксинов и иммуногенности, и следовательно, гораздо лучшая переносимость пациентами и значительно более низкая себестоимость.

Список литературы

1. Orme V.M. et al. Cytokine secretion by CD4+ T-lymphocytes acqured in response to Mycobacterium tuberculosis infection. //J. Immunol. - 1993. - V. 151, N1. - P. 518-525.

2. Di Piro J.T. Cytokine networks with infection: mycobacterial infections leishmaniasis, human immunodeficiency virus infection and sepsis. //Pharmacotherapy. - 1997. - V. 17, N2. - P. 205-223.

3. Ravn P. et al. Human T-cell responses induced by vaccination with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin. //J. Immunol. - 1997. - V. 158, N4. - P. 1949-1955.

4. Заболотных Н.В. и др. Использование рекомбинантного ИЛ-2 в терапии экспериментального туберкулеза. //Молекулярные основы патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии. - М., 1995. - С. 16-17.

5. Johnson B.J. et al. Clinical and immune responses of tuberculosis patients treated with low-dose IL-2 and multidrug therapy. //Cytokines. Mol. Ther. - 1995. - V. 1, N3. - P. 185-196.

6. Shimokata K. Commemorative lecture of receiving imamura memorial prise. Analysis of cellular immunity against tuberculosis in man with special referense to tuberculous pleurisy and cytokines. //Kekkaku. - 1996. - V. 71, N10. - P. 591-596.

7. Condos R., Rom W.N., Schloger N.W. Treatment of multidrug resistant pulmonary tuberculosis with γ-interferon via aerosol. //Lancet. - 1997. - V. 349. - P. 1513-1515.

8. Заболотных Н.В. и др. Способ лечения остропрогрессирующего туберкулеза легких. Приоритетная справка на изобретение. №99114897 от 09.07.99.

9. Иванова Л.А. и др. Ронколейкин в лечении туберкулеза легких //Туберкулез как глобальная проблема здравоохранения на рубеже XXI века: Тез. докл. - С.-Петербург, 1999. - С.106.

10. Пигарева Н.В. и др. Изучение иммуномодулирующей активности нового пептидного соединения бестима. //Иммунология. - 2000. - N1. - С. 33-35.

11. Туманян М.А., Кирилличева Г.В. Изменение 5-нуклеотидазной активности в макрофагах перитонеального экссудата мышей при введении различных иммуностимуляторов. //Иммунология. - 1984. - N5. - С. 29-31.

12. Gillis S. et al. T-cell growth factor: parameters of production and a quantitative microassay for activity. //J. Immunol. - 1978. - V. 120, N6. - P. 2027-2032.

Изобретение относится к медицине, к фтизиатрии и может быть использовано для лечения туберкулеза легких. Вводят бестим в дозе 0,1 мг внутримышечно, ежедневно, курс лечения 5 инъекций. Данное изобретение способствует повышению эффективности лечения больных туберкулезом легких. 3 ил.

Способ лечения туберкулеза легких, включающий этиотропную терапию, отличающийся тем, что вводят бестим в дозе 0,1 мг внутримышечно, ежедневно, курс лечения 5 инъекций.