СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/02 C12N1/16 C12N9/02 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения фермента супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) с помощью микробных культур.

Супероксиддисмутаза катализирует разложение активных радикалов супероксида до перекиси водорода и кислорода, осуществляя тем самым защитные функции в отношении аэробных микроорганизмов.

Этот эффект представляет практический интерес в связи с возможностью его использования, как противовоспалительного средства в медицине и как консерванта в пищевой промышленности.

Первоначально источником супероксидисмутазы служили эритроциты крови и такие животные ткани, как печень, почки, легкие, сердце, мозг и некоторые другие, из которых фермент получали сложными и многостадийными методами.

Затем были разработаны методы получения супероксиддисмутазы с помощью микроорганизмов, в частности таких, как Pseudomonas putida, Nocardopsis, Gluconobacter, рекомбинантные штаммы E. coli.

Для получения фермента микроорганизмы выращивали на подходящих питательных средах в традиционных для этих микроорганизмов условиях и выделяли целевой продукт из клеточной биомассы.

Наиболее близким к предложенному по технической сущности является способ получения супероксиддисмутазы при использовании дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae.

Относительным недостатком этого способа является то, что может использоваться только богатая витаминами ферментационная среда и уровень аэрации должен быть очень высоким.

Цель изобретения - разработка способа, позволяющего получать супероксиддисмутазу микробиологическим методом в промышленных масштабах, используя продуценты, утилизирующие отходы существующих производств.

Поставленная цель была достигнута в результате использования в качестве продуцента супероксиддисмутазы представителей вида дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, способных расти и образовывать значительные количества фермента на отходах молочного производства.

Было установлено, что целый ряд штаммов дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus способны внутриклеточно накапливать супероксиддисмутазу при выращивании на отходах производства сухого молока, концентрированного молока и других молочных продуктов, что видно из данных табл. 1
Из представленных данных видно, что свойство биосинтезировать супероксиддисмутазу присуще исследуемому виду в целом хотя уровень биосинтеза значительно колеблется у отдельных штаммов.

Дальнейшие экспериментальные исследования позволили выявить среди представителей вида Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus умеренно термофильные штаммы, оптимум роста у которых лежит в пределах 40-45^o. Некоторые сведения о них приведены в табл. 2.

Можно заключить, что штаммы Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus различаются по чувствительности к температуре и среди них имеются умеренно термофильные штаммы.

Сущность предложенного способа состоит в том, что штаммы-продуценты супероксиддисмутазы вида Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus выращивают на питательных средах на основе отходов производства молочных продуктов и обеспечивают тем самым накопление в дрожжевых клетках искомого фермента.

В качестве отходов производства молочных продуктов могут быть названы фильтрат молочной сыворотки - отход производства масла, брынзы, сыра, ультрафильтрат молока - отход производства сухого молока и др.

Отходы молочного производства могут являться или единственным питательным субстратом или могут быть обогащены дополнительными источниками питания и/или ростовыми факторами.

Полученная предложенным способом супероксиддисмутаза по своим характеристикам несколько отличается от этого же фермента, полученного из других источников, и это показано в табл. 3
Пример 1. Культуру дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus штамм T₃ заселили в ферментер "Biostat" с рабочим объемом 8,5 л. Выращивание проводили на среде, содержащей стерильный фильтрат молочной сыворотки, обогащенной 10% фильтрата дрожжевого гомогената и 0,3 мг/л никотиновой кислоты. Фильтрат дрожжевого гомогената является производственным отходом при выделении из дрожжевых клеток супероксиддисмутазы или сопутствующих ферментов.

Фильтрат молочной сыворотки содержал 3,28% сахаров. Доза посевного материала составляла 1%.

Культуральная среда имела значение pH 4,5 и это значение поддерживалось в процессе культивирования 12%-ным раствором аммиака.

Процесс культивирования проводился при 35^oC и продолжался 30 ч.

После прекращения процесса выход дрожжевой биомассы составлял 13 г абсолютно сухого вещества с 1 л среды или 40% от содержания в ней сахаров.

В осветленном гомогенате дрожжевых клеток содержание супероксиддисмутазы составило 87 Е/мг белка.

Пример 2. Штамм Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus T₁ выращивали на ультрафильтрате молочной сыворотки с 10% фильтрата гомогенизированных дрожжей. Культивирование проводили при 28^oC в течение 30 ч, поддерживая pH на уровне 4,3 - 4,5. Ультрафильтрат сыворотки содержал 3,9% сахаров. Фильтрат гомогенизированных дрожжей был получен как отход производства при выделении из клеток супероксиддисмутазы.

Выход дрожжевой биомассы составил 40,2% от исходного содержания сахаров.

Накопленную биомассу отделили, промыли фосфатным буфером pH 7,8 и механическим путем разрушили. Активность супероксиддисмутазы в фильтрате бесклеточного гомогената составила 57 E/мг белка.

Заявитель полагает, что предложенный способ получения супероксиддисмутазы отвечает требованиям, предъявленным к изобретению, так как аналогичных способов, предполагающих использование продуцентов из вида Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, способных расти на отходах переработки молока, в доступной литературе не описано.

Источники информации, принятые во внимание
1. Заявка Франции 85 17078, кл. C 12 N 9/02, 1987.

2. Авт. свид. СССР 1413133, кл. C 12 N 9/02, 1986.

3. Патент ГДР 252615, кл. C 12 N 9/02, 1987.

4. Европейский патент 0 218 480, кл. C 12 N 9/02, 1987.

5. Патент Японии 63-48514, кл. C 12 N 9/02, 1988.

6. Патент Японии 63-209584, кл. C 12 N 9/02, 1988.

7. Famg-Jeu. et ak. "Appl. Microbiol. Biotechnol", 1987,26,531.

Использование: биотехнология и касается получения ферментного препарата супероксиддисмутазы. Сущность изобретения: способ состоит в том, что в качестве продуцента супероксиддисмутазы используют культуру Kluyveromycls marxianus var. bulgaricus, которую выращивают на отходах молокоперерабатывающей промышленности - фильтрате молочной сыворотки, обогащенной никотиновой кислотой. Выращивание продуцента осуществляют при 35^oC. 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения супероксиддисмутазы путем выращивания продуцента на среде, содержащей источник углерода и азота, с последующим выделением фермента из клеточной биомассы, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют культуру Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание осуществляют на среде на основе фильтрата молочной сыворотки. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание осуществляют на среде, обогащенной никотиновой кислотой. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве источника никотиновой кислоты используют отходы, образующиеся в процессе выделения фермента. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что выращивание продукта осуществляют при 35^oC.