ШТАММ KLUYVEROMYCES MARXIANUS VAR. BULGARICUS T - ПРОДУЦЕНТ СУПЕРОКСИД ДИСМУТАЗЫ И СОПУТСТВУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/02 C12N1/16 C12N9/04 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологических методов получения ферментных препаратов, а более конкретно способов получения супероксиддисмутазы и сопутствующих ферментов.

Супероксиддисмутаза является металлопротеином и представляет существенный практический интерес в связи с широко проводимыми исследованиями по использованию этого фермента в медицине и пищевой промышленности.

Наиболее известные источники супероксиддисмутазы - эритроциты крови [1] и такие животные ткани, как печень, почки, легкие, сердце, мозг и другие [2] .

Вместе с тем известно и то, что супероксиддисмутаза может быть получена и микробиологическим путем с использованием таких микроорганизмов, как Pseudomonas putida [3], Nocardopsis [4], Gluconobacter [5], Saccharomyces cerevisiae [6], рекомбинантные штаммы E. Coli [7].

Приходится констатировать, однако, что микробиологические методы не нашли пока промышленного применения и используются только в лабораторных условиях.

Поставленная заявителем цель - изыскание штамма-продуцента супероксиддисмутазы, пригодного для осуществления крупномасштабного производства этого фермента в производственных условиях.

Заявитель также имел в виду, что ферментные препараты, получаемые из разных природных источников, могут весьма отличаться по некоторым свойствам.

В результате длительной поисковой и селекционной работы заявителем был выделен и идентифицирован штамм T₃ дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, обладающий искомыми свойствами.

Впервые выделенный заявителем штамм-продуцент супероксиддисмутазы оказался способным накапливать количества супероксиддисмутазы, достаточные для организации рентабельного ее производства, проявил способность активно развиваться и биосинтезировать комплекс ферментов при выращивании на отходах молочного производства, показал умеренную термофильность.

Наиболее ценным качеством вновь выявленного продуцента была способность синтезировать супероксиддисмутазу с повышенной устойчивостью к высоким температурам.

Полученный заявителем новый штамм Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus T₃ депонирован в Национальном банке промышленных микроорганизмов и клеточных культур Национального биотехнологического центра Болгарии под регистрационным номером 1984.

Штамм выделен из сыра и характеризуется следующими признаками.

Рост на солодовом экстракте 15 Б: в процессе роста образует осадок; клетки имеют размеры 0,05-0,1 х 0,2 мкм; размножение осуществляет почкованием.

Рост на солодовом агаре 10 Б: при выращивании при 28^oC за 3-5 дней образуются гладкие колонии с матовой поверхностью, белого цвета, мягкой консистенции, вогнутые, с неровным центром и гладкими краями.

Образование аскоспор: образует 1-2-4 сферические аскоспоры, расположенные по-отдельности или тетрадами на ацетатном агаре, агаре Mc Clari и на солодовом агаре.

Образование псевдомицелл: псевдомицелл не образует.

Образование хламидоспор: на кукурузном и рисовом агаре хламидоспор не образует.

Толерантность к хлористому натрию: устойчив к 8-9 хлористого натрия.

Биохимические характеристики: ферментация сахаров - ферментирует глюкозу, галактозу, сахарозу (100%) и не ферментирует мальтозу, лактозу, раффинозу.

Ассимиляция сахаров - ассимилирует глюкозу, галактозу, сахарозу, лактозу, раффинозу, инулин, D-ксилозу, D-арабинозу, этанол, L - молочную кислоту.

Ассимиляция нитрата калия - не ассимилирует.

Рост на безвитаминных средах - не растет на безвитаминных средах; нуждается в никотиновой кислоте.

Образование пигментов - пигментов не образует.

Расщепление арбутина - арбутин не расщепляет.

Рост на 50%-ном глюкозном агаре - рост отсутствует.

Температура роста - минимальная 5-6^oC, оптимальная 35-42^oC, максимальная 50^oC.

Штамм не показал высокой требовательности к условиям культивирования и оказался способным расти на сравнительно простых средах, используя как основу отходы молочного производства, что частично следует из данных табл.1.

Исходная питательная среда содержала 50 мл фильтрата молочной сыворотки и 50 мл дистиллированной воды и обогащалась компонентами среды Ридера. Начальная концентрация лактозы составляла 16,4 мг/мл. Культивирование проводилось при 40^oC и продолжалось 20 ч.

Полученные результаты показывают, что рост культуры на разведенном вдвое фильтрате молочной сыворотки лимитируется лишь источником азота, а в остальных компонентах среды Ридера не нуждается.

Предложенный штамм показал выраженную зависимость от наличия в среде никотиновой кислоты и это его свойство подтверждается данными табл. 2.

Культивирование проводили на полной среде Ридера, приготовленной на разведенном вдвое фильтрате молочной сыворотки. Начальная концентрация лактозы составляла 16,4 мг/мл. Выращивание продолжалось 20 ч при 40^oC.

Хорошо видно, что нелимитированный рост имеет место лишь при концентрации никотиновой кислоты порядка 75 мкг/100 мл. Однако было показано, что потребность клеток в никотиновой кислоте может быть полностью удовлетворена при введении в ростовую среду до 20% фильтрата дрожжевого гомогената, получаемого при отделении клеточного дебриса.

Параллельно с биосинтезом супероксиддисмутазы штамм биосинтезирует такие сопутствующие ферменты, как бета-галактозидаза и каталаза, которые также представляют практический интерес.

Супероксиддисмутаза, получаемая с помощью предложенного штамма, обладает оригинальными свойствами, отличающими ее от препаратов супероксиддисмутазы, выделяемых из других природных источников, и это показано в табл. 3.

Необходимо отметить, что и накопление предложенным штаммом сопутствующих ферментов - каталазы и бета-галактозидазы - достаточно высоко и составляет примерно 8-10 Δ E/мин/мг и 0,750 Δ E/мин/мг соответственно.

Сущность предложения дополнительно поясняется нижеприведенным примером.

Пример. Штамм Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus T₃выращивали на ультрафильтрате молочной сыворотки - отходе производства молокоперерабатывающего предприятия в г. Силистра. Предварительно сыворотку прогревали при pH 7,3 и подвергали ультрафильтрации через мембрану с размером пор 5 kD. Ультрафильтрат молочной сыворотки был обогащен никотиновой кислотой из расчета 75 мкг никотиновой кислоты на каждые 100 мл среды.

Выращивание проводили в ферментере с рабочим объемом 4 л при температуре 35 градусов, pH 5,0 и pO₂ 30-40% в течение 30 ч. Значение pH поддерживали с помощью 10%-ного раствора гидроксида аммония.

Динамика накопления супероксиддисмутазы и сопутствующих ферментов показана в табл. 4. Активность ферментов определяли в фильтрате разрушенных клеток.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм является оригинальным и имеет существенные преимущества перед известными штаммами-предуцентами супероксиддисмутазы.

Использование: биотехнология и касается получения ферментного препарата суперксиддисмутазы. Сущность изобретения: предлагается штамм дрожжей Kluyveromycls marxianus var. bulgaricus T, способен расти на отходах молокоперерабатывающей промышленности, обогащенных источником никотиновой кислоты. Образуемая при культивировании штамма супероксиддисмутаза обладает умеренно термофильными свойствами. Штамм биосинтезирует одновременно каталазу и бета-галактозидазу. 4 табл.

Штамм Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus T₃ - 1984 (Коллекция Национального банка промышленных микроорганизмов и клеточных культур национального биотехнологического центра, Болгария, София) - продуцент супероксиддисмутазы и сопутствующих ферментов.