СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ИЗ КЛЕТОК ЭУКАРИОТОВ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биотехнологии и касается выделения фермента супероксиддисмутазы из его природных источников.

Супероксиддисмутаза перспективный фермент для использования в медицине как лекарственного средства и для применения в пищевой промышленности в качестве консерванта.

Супероксиддисмутаза содержится в эритроцитах крови, в животных тканях (в печени, почках, легких и других органах животных), может биосинтезироваться такими микроорганизмами, как бактерии и дрожжи.

В зависимости от используемого источника супероксиддисмутазы способы выделения и очистки этого фермента могут существенно отличаться друг от друга.

Известен, например, способ выделения супероксиддисмутазы из животных тканей, заключающийся в том, что исходную ткань гомогенизируют в ацетоне, собирают ацетоновый осадок, гомогенизируют его в фосфатном буфере, гомогенат подкисляют и осветляют. Раствор насыщают сульфатом аммония, добавляют ацетон, декантируют белковую фракцию, собравшуюся в верхнем слое, и растворяют ее в воде. После 50%-ного насыщения раствора сульфатом аммония отделяют и отбрасывают осадок, а затем осаждают активную фракцию при 90%-ном насыщении раствора сульфатом аммония, еще раз растворяют осадок в воде и очищают раствор диализом. Диализат пропускают через колонну с ДЭ-52 целлюлозой, элюируют фермент фосфатным буфером, пропускают через колонку с ДЭАЭ А-50 сефадексом и вновь элюируют целевой продукт буфером. Раствор пропускают через сефадекс G-75 и концентрируют супероксиддисмутазу на ДЭ-52 целлюлозе.

Выход чистого препарата супероксиддисмутазы составляет в среднем 65-67% от исходного количества фермента в гомогенате, его удельная активность равняется 3500-3900 Е/мг белка.

Из 1 кг ткани можно получить 50-300 мг фермента в зависимости от используемого исходного материала [1]
Относительными недостатками способа являются его многостадийность и длительность, процесс продолжается 3 дня.

Описан способ выделения супероксиддисмутазы из эритроцитов крови, заключающийся в том, что кровь подвергают гемолизу, к гемолизату при температуре 4^оС быстро добавляют 0,8 объема смеси хлороформ этанол или хлористый метилен этанол (соотношение компонентов 3:5) и отделяют большинство посторонних белков. В надосадочную жидкость вносят примерно 300 г/л двузамещенного фосфата калия или натрия и оставляют до образования двух фаз.

Верхнюю фазу отделяют, охлаждают до 4^оС и обрабатывают 0,75 объемами охлажденного ацетона для осаждения сырого фермента.

Осадок супероксиддисмутазы растворяют в воде и раствор подвергают диализу через мембрану, задерживающую вещества с мол.м. выше 10 кДа.

Диализат наносят на колонку ДЭАЭ-сефацела, уравновешенную фосфатным буфером с рН 7,8, целевой продукт элюируют фосфатным буфером и при необходимости повторно хроматографируют.

Сырая супероксиддисмутаза, полученная осаждением ацетоном, имеет зеленоватый цвет в растворе и удельную активность 2000-2500 Е/мг белка, а очищенная супероксиддисмутаза обладает в растворе сине-зеленой окраской и удельной активностью 2600-3200 Е/мг белка.

Способ позволяет получить 35-40 мг сырого фермента или 26-32 мг очищенного фермента из 1 л крови [2]
Наиболее близким к предложенному изобретению по технической сущности можно признать способ выделения супероксиддисмутазы из биомассы дрожжей Saccharo- myces cerevisiae, предусматривающий разрушение дрожжевых клеток, обработку щелочной суспензии смесью хлороформ этанол и отделение осадка. В последующем к надосадочной жидкости добавляют двузамещенный фосфат калия, выдерживают систему до образования двух фаз водно-органической, содержащей фермент, и водной, содержащей соли. Сырую супероксиддисмутазу получают осаждением из водно-органической фазы ацетоном.

Для дополнительной очистки солюбилизированный ацетоновый осадок наносят на колонку ДЭ-53 целлюлозы, элюируют фермент фосфатным буфером, элюат пропускают через колонку ДЭАЭ с А-50 сефадексом и вновь элюируют целевой продукт фосфатным буфером.

В результате осуществления способа получают супероксиддисмутазу с удельной активностью до 3300 Е/мг белка.

Выход очищенного фермента составляет до 163 мг с 1 кг абсолютно сухого веса дрожжевой биомассы [3]
Пооперационное сравнение двух последних упомянутых способов показывает их практически полную аналогию, хотя в одном случае супероксиддисмутазу выделяли из эритроцитов крови, а во втором случае из биомассы микроорганизмов.

Это свидетельствует, в частности, о том, что принципиально могут существовать достаточно универсальные способы выделения супероксиддисмутазы из различных природных источников.

По этой же причине оба обсуждаемых способа обладают общим относительным недостатком многостадийностью и определенными технологическими сложностями практической реализации метода в промышленных масштабах.

Цель изобретения упростить способ выделения супероксиддисмутазы и повысить его технологичность.

Цель была достигнута за счет того, что после разрушения клеток исходного биологического материала изолировали активную фракцию с мол. м. 10-100 кДа, сорбировали из нее целевой продукт на ионообменной смоле типа КБ-2Т, а из элюата осаждали примеси органическим растворителем.

Отличия и технологические преимущества предложенного способа перед известными становятся очевидными при анализе данных табл. 1.

Четко видно, что предложенный способ проще и технологичнее любого из известных и, кроме того, более экологичен, так как сводит к минимуму использование органических растворителей и сокращает общий объем производственных отходов.

Существенные отличия предложенного способа от известных показаны в табл. 2, в которой для большей наглядности сравниваются лишь принципиальные схемы выделения супероксиддисмутазы.

К числу явных существенных отличий предложенного способа от известных можно отнести следующие:
при первичном изолировании активной фракции, содержащей целевой продукт, критерием разделения активных и неактивных веществ, в соответствии с предложенным способом, служил непосредственно размер биологических молекул, а не их относительная способность к дегидратации, как в известных способах;
в процессе очистки изолированной активной фракции по предложенному способу первоначально осуществляют этап освобождения от примесей с помощью ионообменной смолы, а затем с помощью органического растворителя, в то время как известные способы предусматривают обратный порядок действий;
при фракционировании активной фракции органическим растворителем по предложенному способу добиваются осаждения посторонних примесей, а в известных способах фракционирование активной фракции органическими растворителями предполагает осаждение целевого продукта.

Сущность предложенного способа состоит в следующем.

Исходный биологический материал дезинтегрируют до разрушения клеток любым известным методом и клеточный дебрис удаляют.

В качестве исходного материала предпочтительнее использовать биомассу микроорганизмов, в частности дрожжей, но могут быть использованы и другие биоматериалы.

Из надосадочной жидкости изолируют активную фракцию с мол.м. 10-100 кДа.

Наиболее удобно изолировать эту фракцию методами ультрафильтрации, но принципиально этого можно достигнуть и иным путем.

При выделении активной фракции с использованием техники ультрафильтрации надосадочную жидкость пропускают через мембрану, задерживающую молекулы с мол. м. большей 100 кДа, а затем через мембрану, пропускающую частицы с размером молекулы менее 10 кДа.

Можно устанавливать и дополнительные мембраны для предварительного удаления более крупных молекул для повышения эффективности процесса.

Целесообразность изолирования именно фракции с размерами молекул 10-100 кДа обосновывается результатами проведенного экспериментального излучения распределения молекул супероксиддисмутазы в различных фракциях фильтрата гомогенатов исходного биологического материала. В качестве примера в табл. 3 приводятся сведения о распределении молекул суперокасиддисмутазы по фракциям гомогената дрожжей Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus при различных вариантах ультрафильтрационного фракционирования.

Изолированную активную фракцию 10-100 кДа вводят в контакт с ионообменой смолой типа КБ-2Т, на которой фермент сорбируется.

Ионообменная смола КБ-2Т слабокислый катионит на основе сополимера метилакрилата с тетравиниловым эфиром пентаэритрита.

Смола предварительно уравновешивается 2-10 мМ фосфатным буфером рН 5,4-6,4.

Супероксиддисмутазу элюируют со смолы солевым раствором, например 0,1-0,25 М раствором хлористого натрия с рН 7,0-7,8.

Наибольшее достоинство ионообменных смол типа КБ-2Т состоит в том, что очистку фермента можно эффективно проводить в стационарных условиях (в объеме), не прибегая к использованию ионообменных колонок (т.е. не в динамическом режиме), о чем свидетельствуют данные табл. 4.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности очистки суперокасиддисмутазы ионообменным методом в стационарных условиях, что имеет большое практическое значение при осуществлении предложенного способа в производственных масштабах.

Для ионообменной очистки в стационарном режиме активную фракцию, полученную изоляцией соединений с мол.м. 10-100 кДа, подвергают контакту с ионообменной смолой, взятой из расчета 15000 Е/г дренированной смолы. Время контакта составляет, как правило, 30 мин. Периодически систему перемешивают.

Смолу предварительно уравновешивают 2-10 мМ фосфатным буфером с рН 5,4-6,4. Однако могут быть использованы и другие буферные растворы.

Исходный раствор удаляют, смолу промывают тем же буфером до отсутствия в промывных водах белка.

Фермент десорбируют со смолы 0,05-0,2 М солевым раствором при рН 7,0-7,8. В простейшем случае десорбцию можно проводить 0,1 М раствором хлористого натрия с рН 7,2-7,6.

В принципе ионообменную очистку супероксиддисмутазы можно осуществлять и в динамическом режиме, используя колонки различной конфигурации.

В элюат медленно при перемешивании добавляют органический растворитель, смешивающийся с водой, до конечной концентрации 25-30 об. Предпочтительно использовать этанол, но допустимо применение ацетона, метанола и других растворителей.

После некоторой выдержки при комнатной или повышенной температуре осаждаются денатурированные посторонние белки, которые отделяют и отбрасывают.

При конечной концентрации органического растворителя ниже 25 об. денатурация примесных белков протекает неполно, и это снижает эффективность очистки. При повышении содержания органического растворителя выше 30 об. может происходить частичное осаждение супероксиддисмутазы.

Наибольший эффект денатурации примесных белков достигается в случае выдерживания реакционной смеси при температуре 38 ± 1^оС. Особенно пригоден этот вариант очистки супероксиддисмутазы при выделении ее из биомассы дрожжей Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus, ряд штаммов которых образует термостабильный фермент.

Некоторые сведения о влиянии концентрации органического растворителя и температуры обработки на эффективность очистки супероксиддисмутазы представлены в табл. 5.

После отделения денатурированных примесных белков раствор, содержащий очищенную супероксидисмутазу, диализуют против дистиллированной воды и лиофильно высушивают.

Эффективность предложенного способа в целом и отдельных его этапов поясняется табл. 6.

В результате осуществления предложенного способа получают супероксиддисмутазу с удельной активностью 3000- 3100 Е/мг белка.

Выход фермента составляет примерно 1 г из 1 кг биомассы дрожжей по абсолютно сухому весу или около 52,0% от содержания в гомогенате биомассы.

Для удобства сравнения технико-экономические показатели предложенного и известных способов выделения супероксиддисмутазы приведены в табл. 7.

Анализируя представленные показатели, можно заключить, что предложенный способ позволяет увеличить выход фермента с высокой удельной активностью.

Возможность достижения поставленной цели была связана с необходимостью использования всех специфических приемов предложенного способа, т.е. при условии первоначальной изоляции соединений с мол.м. от 10 до 100 кДа, последующей их очистки на смоле типа КБ-2Т и завершающего осаждения посторонних примесей органическим растворителем. Несоблюдение, в частности, последовательности этих операций приводит к невозможности получения удовлетворительного результата, подтверждением чего служат материалы табл. 8.

Кроме снижения выхода фермента использование последних двух вариантов способа требует увеличения расхода органических растворителей примерно на порядок, что затрудняет дальнейшие этапы выделения фермента и существенно увеличивает объем производственных отходов.

Необходимость выполнения всех отличительных приемов предложенного способа обусловлена их логической взаимосвязанностью: первоначальное изолирование фракции 10-100 кДа позволяет избавиться от значительного числа примесей, а это в свою очередь способствует специфической сорбции супероксиддисмутазы на ионообменной смоле в отсутствии значительной конкуренции примесных белков, по причине чего оказывается возможным отделить небольшое число сорбировавшихся на смоле примесей их осаждением органическим растворителем.

Разработанная схема выделения супероксиддисмутазы является оригинальной, в доступной патентной и научно-технической литературе не описана, а известные свойства супероксиддисмутазы не позволяли априорно утверждать о возможности и эффективности предлагаемого метода.

Кроме того, как уже выше отмечалось, предлагаемый способ особенно пригоден для выделения сувпероксиддисмутазы из биомассы дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, а свойства фермента из этого продуцента впервые изучены заявителем и несколько отличаются от свойств супероксиддисмутазы, получаемой из других источников.

По мнению заявителя предлагаемый способ отвечает всем предъявляемым к изобретению требованиям и обладает изобретательским уровнем.

П р и м е р 1. В качестве источника супероксиддисмутазы были использованы дрожжи Kluyveromyces marxianum var.bulgaricus T, которые выращивали при 40^оС на питательной среде на основе фильтрата молочной сыворотки.

Биомассу прессованных дрожжей в количестве 900 г суспендировали в 0,1 М растворе хлористого натрия со значением рН, равным 5,5. Суспензия готовилась из расчета 8 г дрожжевой биомассы по абсолютно сухому весу на 1 л раствора.

Суспензию пропускали через проточный дезинтегратор МЛ-1 со скоростью 30 л/ч при температуре 4^оС. Степень разрушения клеток составила в этих условиях 90%
Гомогенат в течение 30 мин центрифугировали при 2500g, осадок промывали тем же солевым раствором и суспензию вновь центрифугировали.

Объединенные супернатанты гомогената дрожжей на ультрафильтрационной установке последовательно пропускали через мембрану с размером пор 0,16 мкм, затем через мембрану с размером пор 100 кДа, а в заключение через мембрану с размером пор 10 кДа, фракция-ретентант на последней мембране содержала 889000 Е активности суперокасиддисмутазы.

Фракцию 10-100 кДа диализовали на мембране с размером пор 10 кДа против дистиллированной воды с рН 5,3. Диализат добавляли к уравновешенной 5 мМ калийфосфатным буфером (рН 5,6) смоле КБ-2Т и перемешивали в течение 30 мин. Смолу отмывали тем же буфером, контролируя отмывку по наличию белка, для чего измеряли оптическую плотность промывных вод при 280 нм.

Отмытую смолу суспендировали в 0,1 М растворе хлористого натрия с рН 7,4 и перемешивали в течение 10 мин, в результате чего суперокасиддисмутаза была полностью десорбирована со смолы.

Элюат содержал 710000 Е супероксиддисмутазы, ее удельная активность была равной 860 Е/мг белка.

При перемешивании к элюату медленно добавили этанол до его конечной концентрации 29 об. нагрели раствор до 38^оС и при медленном перемешивании выдержали 20 мин.

Денатурированные белки отделили центрифугированием при 1500g в течение 10 мин, а супернатант диализовали против дистиллированной воды в течение ночи. Диализат лиофильно высушили.

Удельная активность полученной супероксиддисмутазы равнялась 3150 Е/мг белка.

Суммарный выход суперокасиддисмутазы из 900 г биомассы дрожжей составил 209 мг.

П р и м е р 2. Все изложенное свидетельствует о том, что предложенный способ обладает ощутимыми преимуществами перед известными способами, и основные преимущества состоят в том, что предложенный способ позволяет выделять супероксиддисмутазу из разных природных источников, в том числе из биомассы ранее не известного продуцента дрожжей вида Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus, причем способы выделения супероксиддисмутазы из этих дрожжей не были описаны, а возможность успешного применения известных методик не являлась очевидной;
предложенный способ позволяет получить супероксиддисмутазу с достаточно высокой удельной активностью 3000 3100 Е/мг белка наиболее технологичным методом, не требующим, в частности, использования хроматографических ионообенных колонок и большого объема органических растворителей;
предложенный способ допускает возможность проведения дополнительных этапов очистки уже товарного активного фермента и получения продукта с еще более высокой удельной активностью.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ выделения супероксиддисмутазы состоит в том, что из разрушенных клеток эукариотов изолируют фракцию с мол. м. 10 100 кДа, очищают целевой продукт сорбцией-десорбцией на ионнообменной смоле типа КБ 2Т, а затем фракционируют активную фракцию, осаждая примеси органическим растворителем при концентрации 25 30 об. Причем фракционирование осуществляют этанолом при температуре 37 - 39°С. 4 з.п. ф-лы, 8 табл.

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ИЗ КЛЕТОК ЭУКАРИОТОВ, предусматривающий разрушение клеток, изолирование содержащей фермент активной фракции и ее очистку сорбцией- десорбцией целевого продукта на ионообменной смоле, фракционирование активной фракции органическим растворителем, отличающийся тем, что после разрушения клеток эукариотов изолируют фракцию с мол. м. 10 100 кДа, очистку целевого продукта сорбцией-десорбцией ведут на ионообменной смоле типа КБ-2т, фракционирование осуществляют органическим растворителем при концентрации 25 30% по объему. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракцию с мол. м. 10 100 кДа изолируют методом ультрафильтрации. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что сорбцию-десорбцию целевого продукта осуществляют в стационарном режиме. 4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что фракционирование активной фракции проводят этанолом. 5. Способ по пп. 1 4, отличающийся тем, что фракционирование активной фракции проводят при 37 39^oС.