Способ получения лактатоксидазы Советский патент 1989 года по МПК C12N9/02 C12N9/02 C12R1/02 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения фермента лактатоксидазы, превращающей молочную кислоту (лактат) в пировиноградную кислоту (пируват) и который может быть использован в аналитических системах, применяемых в медицине, пищевой и мик- робиолоической промышленности.

Цель изобретения - упрощение способа,расширение его функциональных возможностей и повьш1ение выхода фермента,

Способ осуществляют следуЮ1цим образом.

В качестве продуцента используют штамм Acetobacter suboxygans var. muciparim Frateur № CIB 5595 (1950 1280). Посевной материал продуцента выращивают на питательной среде, содержащей молочную кислоту, источником которой служит творожная сьгоорот- ка. В ходе сбраживания молока содержащаяся в нем лактоза превращается в молочную кислоту, которая после отделения сгустков молочных белков, т.е. творога, остается в сыворотке и составляет 0,92-1,24%. Концентрации MO-t лочной кислоты в творожной сыворотке менее 0,96% и более 1,24% маловероятны, исходя из режима технологического процесса приготовления 1 ворога. Творожная сыворотка является дешевым отходом технологического процесса приготовления творога.

О1

ю

4

Активность полученной лактатокси- даэы определяют спектрофотометричес- ким методо,м, исходя из схемы заданного способа превращения молочной кислоты: молочная кислота + Оо--

лактатокси--- пировиноградная кислота + . даза

. Метод включает взаимодействие лак- татоксидазы с субстратом - Ь-молочной кислотой в гщтрал-фосфатном буфере рИ 6,5, и детектирование образовавшейся пероксидазой, что визуализируется присутствием в реаки ионной смеси о фенилендиамина. Единицу ак-. тивиости лактатоксидазы выражают количеством фермента,, превращающего 1 мкмоль молочной кислоты в пировино градную кислоту и Н/jC при рН 6,5, 25 С в- течение 1 мин.

Способ поясняется следую1цими примерами .

Пример 1 (контроль). Способ включает следующие этапы: поддерживание культуры в пробирках, выращивание посевного материала в колбах и культивирование микроорганизма в колбах в присутствии молочной кислоты, отделение биомассы, разрушение клеток, центрифугирование их гомогената с целью получения растворимого фермента- сьфца.

Поддерживание культуры Acetobacc«r suboxydane var. muciparum Frateur 1950-1289.

Культура поддерживается в пробирках на скошенном агаре и в колбах с жидкой-питательной средой переменно. Состав агаризованной среды следующий,

г/л: дрожжевой экстракт 10, глюкоза 10; пептон 5; мел 10, агар 15. Источники углерода - глюкоза, сорбит, глицерин, периодически Меняют. Жидкие среды для поддерживания культуры пред

to

20

25

17744

сусла, 500 мл фталатного буфера, рН 5,5. Посевной материал выращивают в течение 1 сут при 25 С на качалке при 150 колебаний/мин.

Посевной материал в количестве 5% переносят в колбы с ферментационной средой, состав которой соответствует указанному в прототипе, г/л: 1,5; .дрожжевой экстракт 1,0; 5,0; 4,0; MgSO 7Н20 0,2; MnSO Н,0 ,0,08; 37,5 мл/л 40%-ной D, L-молочной кислоты, рН среды уравновешивают с до 5,2. Культивирование продуцента проводят в течение 24 ч при 25°С на качалке при 150 колебаний/мин.

Отделение биомассы, ее гомогенизация и центрифугирование клеточного гомогената.

Биомассу отделяют центрифугированием 3000 об/мин в течение 30 мин.Выход биомассы составляет 12 г/л питательной среды, т.е. 2,4 г сухой массы/л из расчета, что сухое вещество клетки составляет около 20%,

Клетки 3-кратно промывают цитрат- фосфатным буфером, рН 6,5, суспендируют в этом же буфере в соотношении 1:3 и обрабатывают ультразвуком частотой 22 кГц в течение 6 мин. Клеточный го- могенат центрифугируют при 100000 g в течение 3,5 ч при 4°С. Супернатант представляет собой фермент-сырец, лактатоксидазная активность которог о достигает 6100 ед/л (6,1 ед./мл). Концентрация белка 6,0 мг/мл, т.е. активность 1 мл фермента в пересчете в соотношении с количеством белка в этом же объеме 1 ед/мл. Выход фермента-сырца в пересчете на 1 л питательной среды (масса биомассы умноженная на объем буфера, в котором она сус- . пендируется, и на активность 1 мл

30

35

40

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способов получения лактатоксидазы. Цель изобретения - упрощение способа, и расширение его функциональных возможностей и повышение выхода фермента. В качестве продуцирующего микроорганизма применяют штамм ACETOBACTER SUBOXYDANS VAR. MUCIPARUM FRATEUR N C1B 5595 (1950-1280), способный синтезировать лакта-оксидазу, окисляющую лактат до пирувата и Н₂О₃, посевной материал которого выращивают на творожной сыворотке, являющейся дешевым натуральным источником молочной кислоты. Способ позволяет получить лактатоксидазу с активностью 7,75 ед/мл, удельной активностью 1,2 ед/мг белка при выходе 790,5 ед/л.

ставляют собой питательные среды, при-. фермента-сырца) 219,6 ед.

50

меняемые для выращивания посевного материала, состав которых приводится №1же. На скошенном агаре культура сохраняется в течение 1 мес, а в жидких средах - 2-3 сут,

Выравщвание посевного материала и культивирование продуцента в колбах.

Бактерии со скошенного агара пере-. сеивают в колбы с питательной средой, состав которой соответствует указанному в Прототипе: 10 г/л 85%-ной D, L-молоЧной кислоты; 5,0 г/л дрожжевого экстракта; 2,0 г/л , j2,0 г/л MgS04 . 7HiO,. 500 мл пивного

Пример 2. Культив продуцента с применением сыворотки в качестве исто ной кислоты для выращиван го материала.

Поддерживание культуры suboxydans var. muciparu 1950-1280 проводят по при севной материал вьфащиваю на питательной среде, при на основе творожной сывор жащей 0,96% молочной кисл бавкой 5,0 г/л дрожжевого рН питательной среды 5,2.

фермента-сырца) 219,6 ед.

Пример 2. Культивирование .. продуцента с применением творожной сыворотки в качестве источника молочной кислоты для выращивания посевного материала.

Поддерживание культуры Acetobaccer suboxydans var. muciparum Frateur . 1950-1280 проводят по примеру 1, Посевной материал вьфащивают в колбах на питательной среде, приготовленной на основе творожной сыворотки, содержащей 0,96% молочной кислоты, с яо- бавкой 5,0 г/л дрожжевого экстракта, рН питательной среды 5,2. Творожную

сыворотку подщелачивают до рН 5,2, автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин и хранят при 4°С. Перед применением дважды фильтруют через бумаж- ньй фильтр.

Далее выращивание посевного материала и культивирование продуцента проводят по примеру 1. Выход биомассы составляет 34 г/л питательной ере- ды (в пересчете на сухую массу 6,8 г/л).

Получение фермента-сырца проводят по примеру 1. Активность полученного образца лактатоксидазы составляет

7750 ед/л, т.е. 7,8 ед./мп. Концентрация белка 7,6 MI /MSI, т.е. активност 1 МП фермента в пересчете в соотношении с количеством белка в этом же объеме 1,2 ед/мг. Выход фермента в пересчете на 1 л питательной среды 790,3 ед.

Пример 3. Поддержание культуры Acecobacter oxydans var. mucipa- rum Trateur 1950-1280 проводят поприме py 1 .Посевной материал выращивают в колбах на питательной среде, приготовленной на основе творожной сыворотки, содержащей 0,96% молочной кислоты, с добавкой 7 МП/л 40%-нЬй молочной кис- (суммарная концентрация 1,24%) и 5,0 г/л дрожжевого экстракта, рН питательной среды 5,2.

I, .

5% (5 мл) инокулята -переносят в ферментативную среду, и процесс далее проводят по примеру 1.

Выход биомассы составляет 32 г/п питательной среды (в пересчете на сухую массу 6,4 г/л). Активность полученного образца лактатоксидазы составляет 7700 ед./л, т.е. 7,7 ед./мп. Выход фермента в пересчете на 1 л питательной среды 739,2 ед.

Преимуществом способа является упрощение получения лактатоксидазы, превращакацей молочную кислоту в пи- ровиноградную кислоту и при применении доступного микроорганизма и простой питательной среды. ;

Формула изоб-ретения

Способ получения лактатоксидазы, предусматривающий выращивание посевного материала продуцента из рода Асе- tobacter на питательной среде, содержащей источник молочной кислоты и дрожжевой экстракт, внесение инокулята посевного материала в ферментаци-. онную среду и культивирование до мак- симальног о накопления фермента, отделение биомассы, ее гомогенизацию и центрифугирование, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, расширения его функцио-: нальных возможностей и повьпдения выхода фермента, в качестве продуцента используют штамм Acecobaccer suboxy- dans vSr muciparura Frateur NCI В 5595, a в качестве основы питательной среды и источника молочной кислоты для выращивания посевного материала используют творожную сыворотку.