ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOALTEROMONAS SP. - ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/40 C12N9/40 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, имеющих значение в решении проблемы универсального донорства, и может быть использовано для, 1 получения высокоактивной α -галактозидазы, применяемой в медицине, генной инженерии, молекулярной биологии.

Разработка эффективного способа получения на местах универсальных по групповым свойствам эритроцитов для неотложной трансфузиологической помощи пострадавшим продолжает в нашей стране быть весьма актуальной.

Большой практический интерес представляют α -галактозидазы, способные удалять α -1,3 -связанные остатки галактозы из гликопротеинов групповых веществ В крови с превращением последних в вещества группы 0 (Н). Такие α -галактозидазы довольно редки. Из литературных данных известно всего шесть α -галактозидаз, способных катализировать трансформацию эритроцитов 0 группы крови B человека в группу крови 0. К ним относятся α -галактозидазы актиномицета Streptomyces sp. (99178) [1] , зигомицета Mortierella vinacea[2], простейших Trichomonas foetus [3], зерен кофе 14,5], сладкого миндаля [6] и сладкого картофеля Colocacia esculenta [7].

В литературе приводились сведения об успешном переливании людям (добровольцам) энзиматически ( α -галактозидазой из зерен кофе) трансформированных эритроцитов [8-11] . Однако для широкого практического применения таких эритроцитов необходимы высокоочищенные специфические ферменты, которые можно получать из доступного и легко воспроизводимого сырья.

Наиболее технологичными источниками ферментов являются микроорганизмы, так как они обладают огромной скоростью размножения и осуществляют синтез биологически активных веществ в контролируемых человеком условиях.

Среди известных бактерий наземного происхождения продуцента фермента с требуемой специфичностью не обнаружено.

Кроме узкой субстратной специфичности огромное значение имеет pH- оптимум фермента. Так, все описанные выше эффективные на эритроцитах ферменты имеют оптимум в кислой области pH, что крайне нежелательно для эритроцитов.

Анализ многочисленных литературных данных показал, что именно бактерии содержат ферменты, одно из свойств которых (оптимум действия при pH 7,0) удовлетворяет технологическим требованиям, предъявляемым к модификации эритроцитов в физиологических условиях.

Морские бактерии как источники ферментов с уникальной специфичностью привлекают все большее внимание исследователей. Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН является обладателем обширной коллекции морских бактерий, собранной в различных районах Мирового океана во время экспедиций научно-исследовательского судна "Академик Опарин". Скрининг среди почти двух тысяч штаммов морских бактерий различных родов и акваторий обитания [12] позволил выявить несколько перспективных штаммов-продуцентов α -галактозидаз, инактивирующих групповую специфичность эритроцитов человека группы крови В.

Задача изобретения - выявление нового штамма, продуцирующего α -галактозидазу с указанными выше свойствами (узкая субстратная специфичность, оптимум действия при pH 7,0 - 7,5), необходимыми для биотехнологии.

Поставленная задача решена тем, что из морской воды выделен штамм бактерий Pseudoalteromonas sp., отобранный по признаку высокой исходной α -галактозидазной активности по п-нитро-фенил- α - D -галактопиранозиду.

Штамму бактерий Pseudoalteromonas sp. присвоен номер КММ 701, он депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-2135 Д.

Штамм выделен методом прямого высева на агаризованную среду следующего состава (г/л): пептон - 5, дрожжевой экстракт -2,5, глюкоза - 1, MgSO₄ - 0,5, K₂HPO₄ - 0,2; морская вода - 750 мл, дистиллированная вода - 250 мл, pH - 7,5.

Культуру хранят в пробирках под слоем минерального масла на полужидкой среде приведенного выше состава, при температуре 10^oC.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

а) Бактерии образуют круглые с ровными краями, выпуклые колонии до 4 мм в диаметре, поверхность колоний - гладкая, консистенция слизистая. Пигмент не накапливается.

б) Штамм ВКМ В-2135 Д представляет собой небольшие грамотрицательные палочки, подвижные с помощью одного полярного жгутика. Хемоорганотрофы с окислительным типом метаболизма. Оксидазо- и каталазоположительные, без NaCl в среде не растут, пигмента не накапливают. Люминесценция и флюоресценция отсутствуют. Растут при 4^oC, при 41^oC рост отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм ВКМ В-2135 Д не гидролизует желатин, крахмал, твин-80. Аргининдегидролаза отсутствует, не денитрификатор. Индол и сероводород не образует. Мелибиозу, мальтозу, сахарозу, глицерин не утилизирует. Штаммы рода Pseudoalteromonas не патогенны и не токсичны для теплокровных животных.

Пример использования штамма морской бактерии Pseudoalteromonas sp. ВКМ В-2135 Д для получения фермента α - галактозидазы.

Ферментацию проводят на модифицированной питательной среде Y-K следующего состава, г/л:
Бактопептон (Difco) - 5,0
Глюкоза - 1,0
K₂HPO₄ - 0,2
Дрожжевой экстракт (Difco) - 2,0
Дистиллированная вода - 500 мл
Морская вода - 500 мл
pH - 7,8
Посевной материал Pseudoalteromonas sp. ВКМ В-2135 Д выращивают в колбах емкостью 250 мл, содержащие 50 мл ферментационной среды, в течение 18-20 ч при 25^oC на качалке со скоростью вращения 150 об/мин до получения плотности 10⁹ клеток/мл.

Полученным посевным материалом засевают колбы емкостью 1000 мл, содержащие 500 мл ферментационной среды того же состава. Ферментацию проводят в течение 24 ч при 25^oC на качалке со скоростью вращения 120 об/мин.

Последовательность процедур выделения и очистки α -галактозидазы из биомассы бактерии и ее очистки традиционна.

α -Галактозидазная активность сосредоточена в биомассе бактерий, а не в культуральной среде. Навеску сырой биомассы суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере, pH 6,8-7,0. Соотношение биомассы и буфера не превышает 0,5 мг на 1 мл. Суспензию озвучивают ультразвуком с частотой 22 кГц (при токе 0,4 А) 4-5 раз по 40 с с 10-20-секундным перерывом на ультразвуковом диспергаторе. Гомогенат центрифугируют 30-35 мин на центрифуге при 15 000 об/мин.

Супернатант подвергают ионообменной хроматографии на колонке DEAE-Toyoperl 650 М фирмы "Toya Soda", Япония (15,5х2), уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером, pH 6,8-7,0. Элюцию проводят линейным градиентом NaCl (0 - 0,5 М) 300/300 мл со скоростью 22 мл/ч.

Фракции, содержащие α -галактозидазную активность объединяют, концентрируют ультрафильтрацией на мембране РМ-ЗО (Amicon, Англия) и наносят на колонку с сефарозой CL-4B фирмы "Pharmacia" (Швеция) (62х2,5см), уравновешенную тем же буфером. Элюируют со скоростью 28 мл/ч.

После гельфильтрации фракции, содержащие α -галактозидазную активность, рехроматографируют на DEAE-Toyoperl 650 М в условиях, указанных выше.

Суммарная α -галактозидазная активность экстракта биомассы, приготовленного описанным выше способом, полностью сорбируется на анионообменнике, и 65% ее элюируется линейным градиентом NaCl при 0,14 М одним симметричным узким пиком. В результате фермент очищается в 5,5 раза (табл. 1). Последующее концентрирование ультрафильтрацией на мембране РМ-ЗО и дальнейшая гельфильтрация на сефарозе CL-6B фракций, содержащих α -галактозидазную активность, приводит к 65- кратной очистке препарата фермента почти без потери активности. Рехроматография на DEAE-Toyoperl 650 М помогает отделить ряд белковых примесей. Для дальнейших исследований берут фракции ферментного препарата, которые соответствуют центральной части пика активности при 0,19 М NaCl. Выход α -галактозидазной активности составляет 30% от активности экстракта, удельная активность увеличивается с 0,1 до 10 ед/мг (табл. 1).

Стандартную гидролитическую активность α -галактозидазы (U) определяют следующим способом: к 50 мкл исследуемого раствора фермента добавляют 450 мкл раствора п-нитрофенил- α -D- α -галактопиранозида производства фирмы "Sigma", США (1 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,0, инкубируют при температуре 20^oC. Реакцию останавливают через 5-20 мин, в зависимости от быстроты развития желтой окраски, добавлением 2,5 мл 1 М Na₂CO₃, и измеряют оптическую плотность раствора при 412 нм на СФ-26 (СССР). Количество выделившегося п-нитрофенола определяют из расчета: 23 мкг /мл соответствует 0,5 ед оптической плотности раствора. За единицу активности принимают количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля п-нитрофенола в 1 мин в условиях определения.

Удельную активность α -галактозидазы считают как отношение ч стандартных единиц на мг белка в единице объема (U/мг белка). Белок определяют по методу Лоури.

В результате применяемой схемы очистки получают препарат фермента, очищенный в 98 раз и не содержащий других гликаназ и гликозидаз.

Фермент имеет оптимум действия при pH 6,7-7,7, требуемый для проведения реакции трансформации эритроцитов человека группы крови B (III) в H (O) в щадящих эритроциты условиях. Это свойство дает существенное преимущество полученного фермента перед уже известными α -галактозидазами из других, указанных выше источников, имеющими оптимумы действия при pH<6.

Фермент не выдерживает замораживания, но неограниченное время сохраняет активность при 4^oC и в течение недели при 20^oC в присутствии 0,1% азида Na, хотя при 30^oC за 10 мин теряет 50% активности.

Молекулярная масса фермента составляет 200 кДа по данным гельфильтрации на сефарозе CL-6B фирмы "Pharmacia" (Швеция).

α -Галактозидаза, полученная из штамма бактерии Pseudoalteromonas ВКМ В-2135 Д испытана в Гематологическом научном центре РАМН (Москва) на способность трансформировать эритроциты группы крови B (III) человека в эритроциты группы H (O).

Нативные эритроциты, кровь и стандартные групповые сыворотки получены от станции переливания крови Гематологического научного центра РАМН. Моноклональные антитела (анти-A, анти-B, анти-H, анти-M, анти-N) - от фирмы "Гематолог" РАМН.

В длительных опытах по трансформации, когда велика вероятность гемолиза, использовались эритроциты, зафиксированные глутаровым альдегидом.

Эффективность фермента при действии на эритроциты устанавливают следующими процедурами. Хорошо отмытые зафиксированные эритроциты смешивают с раствором фермента и после 24 ч инкубации с перемешиванием при 26^oC 3 раза отмывают забуференным физраствором рН 7,3 и смешивают затем с соответствующими сыворотками. После 1 ч инкубации при комнатной температуре с легким перемешиванием производят определение агглютинирующей способности таких абсорбированных сывороток. Агглютинационные тесты осуществляют на 96- круглолуночных планшетах в серии двойных разведений нормальной и/или абсорбированной ("истощенной") сыворотки (растворов антител) с помощью нативных эритроцитов, предварительно отобранных из нескольких образцов донорской крови.

Фиксированные глутаровым альдегидом эритроциты полностью сохраняют структуру АВО-групповых антигенов и соответственно способны специфически адсорбировать антитела [13]. Поэтому, если фермент эффективно инактивирует В антиген, т. е. переводит его в Н(0)- антиген, характеризующий первую (нулевую) группу крови, то адсорбции анти-B антител не происходит (сыворотка не "истощается"), и титр агглютинации нативных эритроцитов соответствующей группы крови не будет отличаться от титра свежей (не "истощенной") сыворотки. Соответственно можно оценивать различную степень инактивации антигенов по изменению титра "истощенных" сывороток. В табл. 2 показаны титры "истощенной" сыворотки после обработки B (III) фиксированных эритроцитов α -галактозидазой из Pseudoalteromonas sp. ВКМ В-2135 Д, которые свидетельствуют об эффективности действия этого препарата фермента на трансформацию эритроцитов группы крови В человека.

В табл. 3 показаны результаты иммунологического изучения нативных незафиксированных эритроцитов, обработанных α -галактозидазой, показавшей свою эффективность на зафиксированных эритроцитах (табл. 2). Видно, что B (III)-антигены трансформированы в O(I)-антиген, т. к. нет агглютинации с анти-B сывороткой. Титр агглютинации с анти-H сывороткой закономерно немного увеличен за счет появления новых H-антигенов (0(I)-антигенов) вместо бывших до того B- антигенов. Такая картина свидетельствует также об отсутствии в образцах фукозидазы, иначе H-антиген был бы инактивирован. Ферментативная обработка не меняет также титр агглютинации с анти-M или анти-N сыворотками, что может свидетельствовать об отсутствии сиалидаз в изученных образцах ферментов. Это очень важно с точки зрения приживляемости трансформированных эритроцитов при введении их г в кровяное русло. α -Галактозидаза, прошедшая процедуру очистки, приведенной в табл. 1, не вызывает также неспецифической агрегации эритроцитов и их гемолиза, что говорит о достаточно высокой чистоте ферментного препарата.

Поставленная задача решена тем, что получен препарат фермента, способный удовлетворить технологическим требованиям: оптимум действия pH 7,0, эффективно действует на эритроциты группы крови B (III).

Источники информации
l. Oishi K., Aida K. //Agric. Biol. Chem. 1972. Vol. 35. P. 578.

2. Улезло И. В., Запрометова О.М. //Прикладная биохим. микробиол. 1982. Т. 18. С. 5.

3. Yates A.D., Morgan W.T.J., Watkins W.M. //FEBS Letts. 1975. Vol. 60. P. 281.

4. Zamitz M. L. , Kabat L. A. // J. Am. Chem. Soc. 1960. Vol. 82. P. 3953.

5. Dey P. M., Pridham J. B. // Adv. Enzymol. 1972. Vol. 36 P. 91.

6. Malhotra O. P., Dey P.M. // Biochem. J. 1967. Vol. 103. P. 508.

7. Chien S.-F., Lin-Chu M. // Carbohydr. Res. 1991. Vol. 217. P. 508.

8. GoldsteinJ., Lenny L. a.a. // Science. 1982. Vol.215. P.164- 170.

9. Goldstein J., in The Red Cell. 1984. P. 130-157.

10. Lenny L., Goldstein J. a.a. // Blood. 1991. Vol.77. P.1383- 1388.

11. Lenny L., Goldstein J. a.a.// Blood. 1994. Vol.84. P.469.

12. Бакунина И.Ю., Иванова Е.П., Недашковская О.М., Горшкова Н.M., Михайлов В.В., Елякова Л.А. // Биология моря. 1997,
13. Ковнер В. Я. , Кульман Р.А. и др. // Гематология и трнсфузиология. 1986. Т.31. С. 21-25.

Изобретение может быть использовано в микробиологии, биотехнологии, медицине. Штамм бактерий Pseudoalteromonas sp. ВКМ В-2135Д рекомендован в качестве продуцента галактозидазы, способной удалять α-1,3-связанные остатки галактозы из гликопротеинов групповых веществ В-крови с превращением последних в вещества группы H (O). Штамм выделен из морской воды методом прямого высева. При культивировании в питательной среде, содержащей, г/л: бактопептон - 5,0, глюкозу - 1,0, K₂HPO₄ - 0,2, дрожжевой экстракт (Difco) - 2,0, дистиллированную воду - 500 мл и морскую воду - 500 мл; рН 7,8, при 25^oC в течение 24 ч культура биосинтезирует α-галактозидазу. Препарат α-галактозидазы выделяют из биомассы высвобождением из клеток путем обработки ультразвуком с последующей очисткой фермента путем ионообменной хроматографии на DEAE - Toyoperl 650-М, гельфильтрации на сефарозе CL-4В и рехроматогафии на DEAE - Toyoperl 650 М. Выход препарата α-галактозидазы с удельной активностью 10 ед/мг белка составляет 30% от содержания ее в сыром экстракте. Фермент имеет оптимум действия при рН 6,7-7,7, молекулярную массу 200 кДа, инактивирует групповую специфичность эритроцитов крови В человека. 3 табл.

Штамм бактерий Pseudoalteromonas ВКМ В - 21315-Д - продуцент альфа галактозидазы.