СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОВОИНГИБИТОРА Российский патент 1999 года по МПК A61K38/55 C12N9/99 

Изобретение относится к медицине и пищевой промышленности, биотехнологии и биохимии и касается способа получения овоингибитора протеиназ, который может найти применение в качествен ингредиента лекарственных препаратов, пищевой добавки, элемента лечебно-профилактического питания.

Развитие неконтролируемого протеолиза является причиной серьезных нарушений в организме, поэтому интенсивно ведется исследование белков-ингибиторов протеиназ, которые можно использовать в заместительной терапии при лечении заболеваний, сопровождающихся избыточной активацией протеолитических систем организма (воспалительные процессы, панкреатит, злокачественные новообразования). Кроме того, ингибиторы протеолитических ферментов используются для стабилизации белковых медицинских препаратов и ограничения протеолиза в пищевой промышленности.

Белковые ингибиторы протеиназ выделяют из различных источников растительного и животного происхождения.

Известен способ ингибитора типа Баумана-Бирк (BBI) из сои культурной, включающий следующие стадии: удаление нерастворимых веществ из соевых бобов, обезжиренных гексаном и подвергнутых экстракции водным раствором кислоты, с целью получения растворимых белковых веществ с концентрацией не ниже 50%; добавление к растворимым веществам сои ацетона с целью получения неочищенного концентрата ингибитора; разбавление концентрата водой; удаление нерастворимых веществ из разбавленного концентрата ингибитора и добавление в него ацетона с целью получения растворимого в воде и нерастворимого в ацетоне концентрата ингибитора Баумана-Бирк; высушивание полученного концентрата [1]. Молекулярная масса соевого ингибитора составляет 8000 Да.

Изучается возможность использования соевого ингибитора при лечении злокачественных новообразований [2].

Известен способ получения панкреатического ингибитора типа Кунитца из органов крупного рогатого скота [3].

Сущность способа заключается в том, что из отходов производства инсулина путем ионообменной хроматографии, химической очистки, высаливания, гель - хроматографии и осаждения выделяют с высоким выходом субстанцию BPTI медицинского назначения, получившую название ингипрол. Молекулярная масса ингибитора типа Кунитца составляет 6500 Да.

Панкреатический ингибитор типа Кунитца является действующим началом лекарственных препаратов, широко используемых в клинической практике, таких как трасилол, гродокс, контрикал и апротинин. Однако существенным недостатком данного ингибитора является его применение в высоких дозах вследствие быстрого удаления из кровотока после внутривенной инъекции, что по-видимому, обусловлено молекулярной массой BPTI. Поэтому весьма актуальным является разработка методов выделения более высокомолекулярных ингибиторов протеиназ из других биологических объектов.

Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получения овоингибитора из яичного белка, включающий осаждение ингибитора трихлоруксусной кислотой с ацетоном с последующим диализом и лиофилизацией осадка; сухой осадок растворяют в небольшом объеме воды, pH раствора доводят до 4,0 и наносят на колонку с KM-целлюлозой [4] . Хроматографию осуществляют ступенчатым градиентом: (1) - раствором 0,1 M аммоний - ацетатного буфера (pH 4,0), которым элюируется фракция, содержащая в основном овомукоид; (2) - 0,1 М аммоний-ацетатный буфером (pH 4,9), которым элюируется фракция, содержащие овомукоид и незначительное количество овоингибитора, и (3) - 0,1 М аммоний-ацетатный буфером (pH 5,0) плюс 1 М NaCl, которым элюируется основная часть ингибитора. После диализа и лиофилизации третья фракция была растворена в 0,005 М Трис-HCl буфере (pH 7,6) и отдиализована против такого же буфера в течение 12 час. Диализованный продукт центрифугируют для удаления нерастворимого материала и наносят на колонку с DEAE-целлюлозой (2,3x45 см), уравновешенной 0,005 М Трис-HCl буфером (pH 7,6). Хроматографию осуществляют линейным градиентом 0,005-0,2 М Трис-HCl буфера (pH 7,6).

Активные фракции объединяют, обессоливают на сефадексе G-25 и лиофилизируют. Получают овоингибитор с молекулярной массой 48000±2 Да.

К недостаткам способа - прототипа можно отнести его длительность (9 стадий выполняются в течение примерно 9 суток) трудоемкость (требуются многократные диализ и лиофилизация продукта). Выход овоингибитора составляет порядка 1,5% от количества исходного яичного белка.

Задача изобретения - получение высокоактивного овоингибитора более простым способом с высоким выходом.

Задача решена тем, что в способе получения овоингибитора, предусматривающем выделение активной фракции из белка куриного яйца и ее хроматографическую очистку, выделение осуществляют дистиллированной водой, а очистку - на полихроме I с элюцией активного белка водой и рехроматографией ингибитора на ионообменном сорбенте.

Сущность способа заключается в следующем. Белок куриного яйца перемешивают с равным объемом дистиллированной воды и полученный раствор центрифугируют. Супернатант сливают, осадок смешивают с водой и вновь центрифугируют. Осадок отбрасывают. В супернатанте определяют белок по методу Доури [5] и ингибирующую активность по отношению к трипсину. В результате получают водный раствор, содержащий белковые компоненты, обладающие высокой ингибиторной активностью по отношению к трипсину (34,5 ИЕ). Затем осуществляют очистку белков, используя гидрофобную хроматографию на полихроме I (политетрафторэтилене). Активный белок элюируют с полихрома дистиллированной водой. Фракции, содержащие активный белок, объединяют и лиофильно высушивают. Элюат содержит основной компонент с молекулярной массой 50120 Да и два минорных компонента с молекулярными массами 81280 и 12700 Да. Ингибиторная активность по отношению к трипсину составляет 33,0 ИЕ. Дальнейшую очистку ингибитора проводят с использованием ионообменной хроматографии. Элюцию осуществляют 0,001 М аммоний-ацектатным буфером pH 4,5. При этом активный белок выходит сразу за свободным объемом. Ингибирующие трипсин фракции объединяют и высушивают лиофильно. Выход очищенного овоингибитора составляет 47,0% внесенного на колонку белка или 19,74% в пересчете на исходный водорастворимый белок куриного яйца. Длительность выделения - примерно 4 дня.

Предлагаемый способ получения овоингибитора из белка куриного яйца отличается тем, что уже на первой стадии выделения концентрируются фракция нативных компонентов, обладающих высокой ингибирующей активностью по отношению к трипсису (34,5 ИЕ); на второй стадии (очистка на полихроме I) выделяется овоингибитор всего двух минорных белков. Высокая емкость сорбента и его гидродинамические свойства позволяют получать препаративные количества вещества и сокращают время очистки. На третьей стадии получен чистый овоингибитор с высоким выходом - 19,74% от исходного белка куриного яйца и высокой ингибирующей активностью по отношению к трипсину (26,7 ИЕ).

Возможность осуществления заявляемого способа иллюстрируется примером.

Пример.

К белкам 5 яиц (объем 170 мл, вес 170 г) добавляют равный объем дистиллированной воды, перемешивают механически до появления белого слизистого осадка и полученный раствор центрифугируют в течение 15 минут на центрифуге К-70 (ГДР) при 6000 об./мин. Желтоватый супернатант сливают, осадок смешивают с 50 мл воды и вновь центрифугируют. Супернатанты объединяют, а осадок отбрасывают. Белок в растворах при всех операциях определяют по методу Лоури. Ингибирующую активность по отношению к трипсину определяют с помощью синтетического субстрата - N-бензоил-D, L-аргинина п-нитроанилида (БАПА). Расчеты основаны на определении количеств ингибитора, необходимых для достижения 50% ингибирования в 1 минуту при пересчете на 1 г трипсина.

В результате получают водный раствор, содержащий 12 г белка (по Лоури) с удельной активностью 34,5 ИЕ.

Белок наносят на колонку с полихромом (17х4 см), предварительно уравновешенным водой. После нанесения всего супернатанта полихром промывают дистиллированной водой до полного удаления несвязавшегося активного белка. Элюент (1,5 л), содержащий активный белок (42% от исходного), объединяют и высушивают лиофильно. Гомогенность белка и его молекулярную массу определяют электрофорезом в 15% ПААГ с 1% додецилсульфатом натрия в присутствии β- меркаптоэтанола в препарате белка по методу [6]. В качестве белков - маркеров используют набор стандартов для определения молекулярного веса "Serva" (ФРГ).

Элюат содержит основной компонент с молекулярной массой 50120 Да и два минорных компонента с молекулярными массами 81380 и 12700 Да, по-видимому, овотрансферрил и цистатин соответственно. Ингибиторная активность по отношению к трипсину составляет 33,0 ИЕ.

Дальнейшую очистку ингибитора проводят с использованием ионообменной хроматографии: 1,8 г лиофилизированного элюата растворяют в 5 мл 0,001 М аммоний-ацетатного буфера с pH 4,5 и наносят на колонку с SP-Сефадексом G-25 (35x1,7 см), уравновешенным тем же буфером. Элюцию осуществляют исходным буфером со скоростью 7 мл/мин. При этом активный белок выходит сразу за свободным объемом. Ингибирующие трипсин фракции объединяют и высушивают лиофильно. Выход очищенного ингибитора (840 мг) составляет 47% от внесенного на колонку белка (19,74% в пересчете на исходный белок). Гомогенность препарата доказана электрофорезом в ПААГ. Молекулярная масса - 50120 Да. Ингибиторная активность по отношению к трипсину равна 26,7 ИЕ. В 0,1 М Трис-HCl буфере (pH 8,0) белок имеет максимум адсорбции при 280,9 нм с коэффициентом E0,1280,9

Литература
1. Патент США N 5217717, 78, 47/00; B 11B 1/00; A 23 L 1/20, 1993.

2. Witschi H., Kennedy A.R. // Carcinogenesis, 1989. V. 10. P2275-2277.

3. Ларионова Н. И. , Балабушевич Н.Г., Гладышева И.П., Мороз Н.А., Казанская Н. Ф. , Полехина О.В., Донецкий И.А. // Вопросы медицинской химии. 1994. Т.40. N 3. С. 25-31.

4. Liu Woo-Hoe, Means Gary E., Feeney Robert E. // Biochim. Biophys. Acta. 1971. V.229. P. 176-185.

5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A. L., Randall J. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-275.

6. Остерман Л.А. // Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М. "Наука". 1981.

Изобретение относится к медицинской и пищевой промышленности, биотехнологии и биохимии, может найти применение в качестве ингредиента лекарственных препаратов, пищевой добавки, элемента лечебно-профилактического питания. Из белка куриного яйца выделяют нативную фракцию дистиллированной водой, очищают ее на гидрофобном сорбенте полихроме 1, уравновешенном водой. Элюцию активного белка ведут дистиллированной водой с последующей рехроматографией ингибитора на ионообменном сорбенте - SP - Сефадексе G25. Получен овоингибитор с более высоким выходом -19,74 % от исходного белка водорастворимой части белка куриного яйца, с мол. м. 50120 Да и ингибирующей активностью по отношению к трипсину 26,7 ИЕ.

Способ получения овоингибитора, предусматривающий выделение активной фракции из белка куриного яйца и ее хроматографическую очистку, отличающийся тем, что выделение осуществляют дистиллированной водой, а очистку - на полихроме 1 с элюцией активного белка водой и рехроматографией на ионообменном сорбенте.