СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ Российский патент 1997 года по МПК C12P1/06 

Изобретение относится к медицине и фармакологии, точнее к способам выделения природных антибиотиков непосредственно из ферментационных сред, без предварительного отделения биомассы и получения отфильтрованной ферментационной среды с растворенным в ней антибиотиком так называемого нативного раствора.

Известны способы получения антибиотиков, например, стрептомицина /1 5/, непосредственно из ферментационной среды или культуральной жидкости (кж). Метод заключается в пропускании через неподвижный слой сорбента предварительно специальным образом обработанной с целью уменьшения вязкости кж так называемый динамический способ.

Главным недостатком динамического способа является высокое гидродинамическое сопротивление слоя сорбента движению вязкой суспензии (именно так характеризуется кж по своему физико-химическому состоянию) и, как следствие, унос сорбента и потери продукта. Другим существенным недостатком является необходимость термической обработки кж для понижения вязкости и как следствие термической обработки появление нежелательных примесей в целевом продукте.

Прототипом изобретения может служить авт.св. N 1271078 от 1988 [6] Способ согласно прототипу заключается в том, что предварительно рассеянный сорбент с размером зерен 1,0 1,6 мм (вместо 0,3 1,6 мм, выпускаемых промышленностью) добавляют в кж, и сорбцию ведут в режиме "блуждающие колонии" (имитация противоточного динамического метода). Извлечение антибиотика из аликвоты кж проводят следующим образом. Имеется система емкостей-ступеней от 5 до 10, в которые загружают аликвоты предварительно просеянного катионита. Аликвоту кж делят на равные порции, первую порцию кж приводят в контакт с аликвотой катионита в 1-ой емкости (ступени) на строго определенное время (30 мин) это 1-ый цикл (1 стадия) на 1-ой ступени сорбции. Для проведения 2-го цикла в 1-ой емкости отработанную в 1-ом цикле кж отделяют на сите и перемещают ее во 2-ую емкость, а сорбент в 1-ой емкости заливают свежей порцией кж и так далее, перемещая непрерывно из емкости в емкость кж и сорбент противотоком относительно друг друга с разделением на сетке между емкостями (ступенями). По мере насыщения сорбента в 1-ой емкости за несколько циклов или стадий (по прототипу в примере 2 за 13 циклов или стадий, а в примере 4 за 19 циклов для гентамицина, а для других антибиотиков 35 /7/) он выводится из процесса; отделяется на сите, промывается несколько раз водой и переносится в колонну для дополнительной отмывки водой и проведения выделения антибиотика известными приемами. Место 1-ой емкости занимает 2-ая, в хвост системы вводят новую емкость со свежей порцией сорбента, сохраняя общее количество ступеней сорбции. Недостатками указанной работы является следующее.

Во-первых, в прототипе процесс извлечения продукта из кж оценивается только по "сбросным концентрациям", т.е. по остаточной концентрации антибиотика в отработанной кж (маточнике) после сорбции. Однако, процесс извлечения вещества путем сорбции неразрывно связан с обратным процессом - десорбцией и получением целевого продукта в виде технического элюата. Причем при высокой степени сорбции обратный процесс десорбции (элюции) может протекать с очень низким выходом (неполная отдача вещества при элюмии или, по-другому, необратимость сорбции). Кроме того, в "сбросных концентрациях" может иметь место инактивация антибиотика и поэтому характеризовать степень извлечения по сбросным концентрациях недостаточно, необходимо получить продукт в явном виде т.е. в виде технического элюата. Следовательно, общая степень извлечения целевого продукта из кж, включая процесс сорбции и десорбции, может быть довольно низка, несмотря на высокую степень сорбции, что и имеет место в прототипе. При заявленной высокой степени сорбции и очень низкой степени десорбции и общий выход на стадиях сорбции-десорбции и получения целевого продукта в виде технического элюата, что является действительной характеристикой степени извлечения, в заявленном прототипе довольно низок и достигает 34%
В предлагаемом способе выход целевого продукта в техническом элюате от 94 до 97%
Во-вторых, многоступенчатость и многоцикличность процесса: число ступеней от 5 10, на каждой из которых проводят по несколько циклов извлечения от 13 до 35 при затрате 30 мин на каждый цикл. Как следствие, растягивание процесса сорбции во времени, только на чистое время контакта кж-сорбент по прототипу требуется для гентамицина от 6,5 10 ч, для мономицина до 17 ч /7/, не считая времени, необходимого на отделение отработанной в каждом цикле кж на сите с последующим перемещением этой порции кж на следующую ступень для следующего цикла.

В предлагаемом способе контакт сорбента с кж осуществляется одноразово, т. е. один цикл на одной ступени с общим временем сорбции от 4 до 6 ч вне зависимости от объема кж.

В-третьих, порционное насыщение сорбента на каждой ступени и индивидуальное отделение насыщенной порции сорбента на сите, как следствие неравномерность насыщения каждой порции сорбента, например для гентамицина, от 12 до 339 мг/г на катионите Вофатит СР и от 18 до 258 мг/г на катионите КБ-2 /7/.

В предлагаемом способе предлагается для практически полного извлечения антибиотика из кж только одна равномерно насыщенная порция сорбента, которая имеет на катионите КБ-2 насыщение 270 мг/г для гентамицина и даже выше для других антибиотиков.

В-четвертых, низкая производительность (эффективность) процесса. Извлечение антибиотика из кж с помощью сорбента, как выше отмечали, автоматически предполагает десорбцию (элюцию) антибиотика с сорбента и получение целевого продукта в виде технического элюата, но на десорбции используются только максимально насыщенные катиониты. По прототипу в каждой операции извлечения максимально насыщается только одна порция сорбента на первой ступени, уже вторая порция на второй ступени имеет значительно меньшее насыщения. В примере 4 по прототипу насыщение (емкость) на первой ступни 339,2 мг/г, на второй уже меньше 234,6 мг/г, но авторы считают, что обе эти порции насыщены, т. е. 20 мл сорбента. На стадию десорбции можно взять только 20 мл сорбента вместо 50 мл сорбента, взятых в операцию (опыт) для извлечения гентамицина из кж объемом 3900 мл до получения "сбросных концентраций" в первом опыте 10 мкг/мл и во втором опыте 15 мкг/мл. Выход целевого продукта в виде технического элюата будет даже меньше 34% В то время как в предлагаемом способе для извлечения из того же объема кж и с той же концентрацией нужна одна порция катионита объемом 100 мл, которая сразу после 4 ч контакта с кж будет во всем объеме 100 мл использована для десорбции.

В-пятых, в прототипе существуют необходимость предварительного рассева сорбента, получение узкой фракции сорбента с размером зерен 1,0 1,6 мм и использование в работе только этой фракции, а остальной сорбент, что составляет 50% (катиониты выпускаются стандартно с размером зерен 0,3 1,6 мм [8] ), вероятно, как следствие этого способа идет в отход.

Высокая степень сорбции (по "сбросным концентрациям") в прототипе получена с использованием сорбентов, не выпускаемых серийно отечественной промышленностью и отсутствующих в ГОСТе; СГ-1М, КБ-2Н-2,5, или зарубежного производства Вофатит СР. При использовании же отечественного серийно выпускаемого в соответствии с ГОСТом [8] сорбента КБ-2 достигается более низкий выход по сорбции 76,7%
Цель изобретения повышение выхода целевого продукта, упрощение процесса и создание безотходной технологии. Цель достигается тем, что товарный сорбент (0,3 1,6 мм), т.е. без предварительного рассева вносят непосредственно в кж, содержащую 0,05 0,1% поверхностно-активного вещества (ПАВ) катионного характера, а также уже связанные в комплекс щелочноземельные металлы, и проводят одноступенчатое и одноциклическое извлечение антибиотика с равномерным насыщением всей порции сорбента.

Сущность метода заключается в следующем: непосредственно в аппарат, снабженный мешалкой, где находится кж антибиотика со связанными в комплекс щелочноземельными металлами, например оксалат-ионами, триполифосфатом натрия, вносят 0,05 0,1% ПАВ, например, N-алкилпиридиний бромид (цетазол), акилтриметиламмоний хлорид (АТМАХ), и катионит в солевой форме. После нескольких часов перемешивания и достижения кинетического равновесия в системе (4 6 ч) катионит с сорбированным целевым продуктом отделяют на вибрирующем сите с размером ячеек 0,25 мм методом просеивания. Отделенный на сите сорбент переносят в колонну для отмывки от мицелия и проводят десорбцию (элюцию) антибиотика известными приемами с целью получения технического продукта (элюата). Выход целевого продукта по содержанию антибиотика в элюате от 94 до 97% от исходного содержания антибиотика в кж.

Существенным отличием предлагаемого способа от прототипа является то, что в кж перед сорбцией добавляют компоненты (например оксалат-ионы, триполифосфат натрия), связанные в комплекс конкурентноспособные к сорбции ионы кальция и магния, мешающие сорбироваться антибиотику (уменьшающий насыщение по антибиотику), а также 0,05 0,1% поверхностно-активного вещества катионного характера. Установлено, что именно ПАВ катионного характера повышают насыщение и избирательность сорбента по отношению к антибиотику, а также частично лизируют клетки микроорганизма, продуцирующего антибиотик в кж, понижая вязкость и измельчая их, что способствует наиболее полному отделению отработанной кж с остатками лизированных клеток (мицелия) от катионита с сорбированным целевым продуктом даже при использовании сита с размером ячеек 0,25 мм. Это дает возможность использовать весь диапазон размера зерен товарного сорбента, выпускаемого с размерами 0,3 1,6 мм, а также проводить процесс извлечения при одноразовом акте сорбции за один цикл и на одной ступени при высокой степени насыщения сорбента.

Отличием предлагаемого способа является то, что целевой продукт получают в виде технического элюата и высокий выход по заявленному способу уже учитывает все потери при десорбции целевого продукта с сорбента и равен 94 - 97% против предположительных 34% по прототипу.

Преимуществом предлагаемого способа является следующее.

Во-первых, высокий выход целевого продукта в виде технического элюата от 94 97% в сравнении с предположительными 34% в прототипе.

Во-вторых, одноразовый акт сорбции вместо многоступенчатого и многоцикличного акта сорбции по прототипу (от 5 до 10 ступеней) сорбции, на каждой из которых проводят от 13 до 35 циклов), что является значительным упрощением процесса.

В-третьих, сокращение времени извлечения от 4 до 6 ч вместо 6,5 17 ч по прототипу.

В-четвертых, одноактовое (одноразовое) насыщение всего необходимого количества сорбента для извлечения из данного объема кж (получение всего целевого продукта в сорбированном виде для последующей элюции) в отличие от дробления общей порции сорбента на отдельные аликвоты с неравномерным насыщением каждой и получением только некоторой доли готового продукта в сорбированном виде по прототипу, что ведет к высокой производительности (эффективности) процесса.

В-пятых, в предлагаемом способе товарный сорбент используется как таковой без предварительного рассева, в то время, как в прототипе используют только узкую фракцию размеров зерен 1,0 1,6 мм, а так как все сорбенты производят более широкого диапазона с размерами 0,3 1,6 мм, то по прототипу фракция 0,3 1,0, что составляет примерно 50% от всех зерен, является отходом производства.

Высокая степень сорбции и последующей десорбции в предлагаемом способе получена на доступных серийно выпускаемых отечественной промышленностью сорбентах в соответствующие с ГОСТом [8] в то время как в прототипе высокие показатели получены только на стадии сорбции и при использовании сорбентов, отсутствующих в ГОСТе или зарубежных.

Пример 1.

К 500 мл культуральной жидкости сизомицина с активностью 350 мкг/мл вносят 3,25 г оксалата аммония для связывания солей кальция, имеющихся в культуральной жидкости, в нерастворимый комплекс. Массу перемешивают в течение 10 15 мин, после чего 12 н раствором серной кислоты доводят pH культуральной жидкости до значения 6,0 6,2. Затем в обработанную культуральную жидкость добавляют 5 мл 10%-ного водного раствора цетазола[C_nH_2n+1NC₆H₅] ⁺Br^-, где n= 16^oC20} т.е. 0,1% ПАВ к объему кж; добавляют затем 10 мл товарного катионита КБ-2 в солевой форме с размером зерен всего диапазона серийного производства 0,3 1,6 мм, оставляют на 4 часа при перемешивании. Затем отделяют отработанную кж на сите с размером ячеек 0,25 мм. Получают 480 мл отработанной кж с активностью 4 мкг/мл, сорбировано 99% антибиотика с насыщением сорбента 156•10^-3 мкг/г.

Катионит с сорбированным целевым продуктом переносят в десорбционную колонну, промывают водой, путем подачи воды снизу вверх в колонну. После промывки через колонну сверху вниз пропускают 2 н. раствор аммиака со скоростью 5 мл/ч.

Получают 20 мл технического элюата сизомицина с активностью 8225 мкг/мл. Выход сизомицина в элюате составляют 94% от содержания антибиотика в культуральной жидкости.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в качестве ПАВ добавляют 10% -ный водный раствор алкилтриметиламмоний хлорада (АТМАХ)[C_nH_2n+1N(CH₃)₃] ⁺Cl^-, где n= 10 - 16} Показатели выхода целевого продукта такие же, как в примере 1.

Пример 3. Отличается от примеров 1 2 тем, что добавляют 2,5 мл 10%-ного раствора цетазола или АТМАХ, т.е. 0,05 ПАВ по отношению к объему кж. Показатели выхода целевого продукта такие же, как в примерах 1 2.

Пример 4. Отличается от примеров 1 3 тем, что добавляют 1,5 мл 10-ного раствора цетазола или АТМАХ т.е. 0,03% ПАВ по отношению к объему кж. Получают 470 мл отработанной кж с активностью 52 мкг/мл, сорбировано всего 86% антибиотика с насыщением сорбента 135•10³ мкг/г. После десорбции получают 20 мл технического элюата с активностью 7260 мкг/мл, что составляет общий выход целевого продукта 83%
Пример 5. Отличается от примеров 1 4 тем, что добавляют 6,5 мл 10-ного водного раствора цетазола или АТМАХ, т.е. 0,13% ПАВ по отношению к объему кж. Получают 470 мл отработанной кж с активностью 48 мкг/мл, сорбировано всего 87% антибиотика с насыщением сорбента 137 мг/г. После десорбции получают 20 мл технического элюата с активностью 7440 мкг/мл, что составляет общий выход целевого продукта 85%
Пример 6. Отличается от примеров 1 5 тем, что добавляют 5 мл 10-ного водного раствора ПАВ анионного характера -алкилбензолсульфонат натрия [C_nH_2n+1C₆H₄SO₃] ^-Na⁺, где n=12^oC18} т.е. 0,1 ПАВ по отношению к объему кж. Получают 450 мл отработанной кж с активностью 70 мкг/мл, сорбировано 82% антибиотика с насыщением сорбента 129 мг/г. После десорбции получают 25 мл технического элюата с активностью 5250 мкг/мл с выходом целевого продукта 75% от исходного содержания антибиотика в кж.

Пример 7. Отличается от примеров 1 6 тем, что добавляют 5 мл 10-ного водного раствора неионогенного ПАВ Синтамид-5 или N-моно-(2-полиэтиленгликольэтил)амид СЖК (синтетические жирные кислоты). [C_nH_2n+1CONHCH₂CH₂O(C₂H₄O)_mH, где n=10^oC16, m=5^oC6] т.е. 0,1% ПАВ по отношению к объему кж. Получают 460 мл отработанной кж с активностью 65 мкг/мл, сорбировано 83% антибиотика с насыщением сорбента 131 мг/г. После десорбции получают 25 мл технического элюата с активностью 5390 мкг/мл с выходом целевого продукта 77% от исходного содержания антибиотика в кж.

Пример 8. Отличается от примеров 1 7, тем что ПАВ не добавляют вообще. Получают 460 мл отработанной кж с активностью 53 мкг/мл, сорбировно 86% антибиотика с насыщением сорбента 135 мг/г. После десорбции получают 22 мл технического элюата с активностью 6360 мкг/мл с выходом целевого продукта 80%
Пример 9. Отличается от примеров 1 3 тем, что сорбцию сизомицина из культуральной жидкости проводят в присутствии солей кальция, магния, т.е. культуральную жидкость не обрабатывают ни щавелевой кислотой, ни оксалатом аммония, ни комплексонами другого характера. Получают 470 мл отработанной кж с активностью 130 мкг/мл сорбировано 65% антибиотика с насыщением сорбента 102 мг/г. После десорбции получают 20 мл технического элюата с концентрацией антибиотика 5425 мкг/мл. Выход целевого продукта в техническом элюате 62% от исходного содержания антибиотика в кж.

Пример 10. Отличается от примеров 1 3 тем, что в 400 мл культуральной жидкости гентамицина с активностью 625 мкг/мл вносят 3,6 г оксалата аммония. Массу перемешивают 10 15 мин, после чего 12 н. раствором серной кислот доводят pH культуральной жидкости до значения 6,0 6,5. Затем 10 мл сорбента КБ-2Н-2,5 вносят в кж и проводят сорбцию. Получают 390 мл отработанной кж с активностью 6,4 мкг/мл. Сорбировано 99% при насыщении сорбента 223 мг/г.

Десорбцию проводят как в примере 1. Получают 20 мл технического элюата с активностью 12000 мкг/мл. Выход целевого продукта в техническом элюате составляет 96% от содержания антибиотика в культуральной жидкости.

Пример 11. Отличается от примера 10 тем, что десорбцию гентамицина проводят путем пропускания сверху вниз через слой сорбента в десорбционной колонне 1н раствора серной кислоты со скоростью 5 мл/ч. Получают 20 мл технического элюата с активностью 12000 мкг/мл. Выход целевого продукта от содержания в кж составляет 96%
Пример 12. Отличается от примера 1 3 тем, что берут 250 мл кж гентамицина с активностью 1200 мкг/мл. После связывания солей щелочноземельных металлов в комплекс и добавления ПАВ доводят общий объем суспензии обессоленной или дистиллированной водой до 500 мл. Затем вносят 10 мл сорбента КБ-2 в солевой форме и оставляют на 4 часа. Получают 980 мл отработанной кж с активностью 3,2 мкг/мл, сорбировано 99% с насыщением сорбента 267 мг/г.

После десорбции получают 20 мл технического элюата с концентрацией 14550 мкг/мл. Выход целевого продукта в техническом элюате 97%
Пример 13. Отличается от примера 1 3 тем, что в 100 мл культуральной жидкости стрептомицина с активностью 15000 мкг/мл добавляют 19 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты. После перемешивания в течение 10 15 мин добавляют 10 мл насыщенного раствора триполифосфата натрия и затем после 15 мин перемешивания доводят pH культуральной жидкости 12 н. раствором едкого натра до значения 6,0 6,2 и ее разбавляют обессоленной водой в 3,5 раза. Добавляют к 350 мл разбавленной культуральной жидкости 10 мл сорбента КБ-2Н-2,5 или КБ-2 в натриевой форме. Массу перемешивают в течение 6 ч. Получают 340 мл отработанной культуральной жидкости с активностью 44 мкг/мл. Сорбировано 99% при насыщении сорбента 1,34 г/г.

Десорбцию проводят как в примере 1. В качестве элюента используют 1 н. раствор серной кислоты, которую пропускают через слой сорбента со скоростью 3,5 4 мл/ч. Получают 20 мл технического элюата с активностью (с концентрацией) 72000 мкг/мл. Общий выход антибиотика в техническом элюате составляет 96% от содержания его в культуральной жидкости.

Пример 14. Отличается от примера 1 3 тем, что к 100 мл культуральной жидкости канамицина с активностью 3000 мкг/мл добавляют 3,7 г щавелевой кислоты. После осаждения солей кальция доводят pH культуральной жидкости 12 н. раствором едкого натра до значения 6,0 6,2. В качестве сорбентов используют КБ-2, КБ-2Н-2,5, КБ-4. Получают 150 мл отработанной кж с активностью 32 мкг/мл, сорбировано 99% антибиотика при насыщении сорбента 428 мг/г. После десорбции получают 20 мл технического элюата с активностью 23280 мкг/мл, что составляет 97% от содержания антибиотика в кж.

Пример 15. Отличается от примеров 1 3 тем, что к 320 мл культуральной жидкости полимиксина с концентрацией 1500 мкг/мл добавляют 1,6 г щавелевой кислоты. После осаждения солей кальция доводят pH культуральной жидкости 12 н. раствором едкого натра до значения 6,0 6,2. Сорбцию проводят в течение 6 ч. Получают 300 мл отработанной культуральной жидкости с концентрацией 16 мкг/мл. Сорбировано 99% антибиотика при насыщении сорбента 427 мг/г. Десорбцию полимиксина проводят как в примере 1. В качестве элюента используют 1 н. раствор серной кислоты, которую пропускают через слой сорбента со скоростью 2 4 мл/ч. После десорбции получают 22 мл технического элюата с концентрацией 20727 мкг/мл, что составляет 95% от содержания антибиотика в культуральной жидкости.

Использование: медицина, фармакология, способы выделения природных антибиотиков. Сущность изобретения: в способе выделения антибиотиков путем их сорбции, в культуральную жидкость предварительно добавляют компоненты, связывающие щелочноземельные металлы и 0,05 - 0,1 %, поверхностно активного вещества, затем проводят сорбцию антибиотиков на катионите с размером гранул 0,3 - 1,6 мм и отделяют целевой продукт.

Способ выделения антибиотиков путем сорбции их из культуральной жидкости на катионите и отделения целевого продукта, отличающийся тем, что в культуральную жидкость предварительно добавляют компоненты, связывающие щелочноземельные металлы, и 0,05 0,1% поверхностно активного вещества катионного характера, а сорбцию проводят на катионите с размером гранул 0,3 - 1,6 мм.