ШТАММ STREPTOMYCES GRISEOCARNEUS SUBSP. BLEOMYCINI ВКПМ-S1086 - ПРОДУЦЕНТ БЛЕОМИЦЕТИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА БЛЕОМИЦЕТИНА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12P19/58 C12R1/465 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика блеомицетина, широко используемого в терапии плоскоклеточного рака.

Блеомицетина гидрохлорид. Мол. Масса = 1586,4.

Противоопухолевый антибиотик блеомицетин (в зарубежных фармакопеях не описан) является представителем группы антибиотиков-гликопептидов, к которой относится применяемый в медицинской практике антибиотик блеомицин (Bleocin, Nippon Kayaku, Japan и Blenoxan, Bristol Mayer's, USA). В отличие от блеомицина, блеомицетин является монокомпонентным препаратом, представленным блеомицином А₅. Зарубежные препараты являются смесью нескольких компонентов, главными из которых являются блеомицины А₂ и В₂.

Блеомицетин отличается от многокомпонентных зарубежных аналогов пониженной легочной токсичностью.

Известен штамм Streptoverticillium subsp. bleomycini (ИНА-1706) - продуцент антибиотика блеомицетина [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 70 мкг блеомицетина в 1 мл культуральной жидкости).

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент блеомицетина в результате двухступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм №1706 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих акридиновые красители в субингибирующих рост концентрациях.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП-S1086.

Штамм ВКМП-S1086 обладает повышенной продуктивностью блеомицетина (120 мкг в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКМП-S1086. Температура 37°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культуры штамма, выращенного на овсяном агаре. Цвет определен по таблице Бондарева и Праузера (табл.1):

Микробиологические признаки.

Гифы воздушного мицелия прямые или извилистые, цепочки спор прямые, расположены мутовчато, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб растет при (24-37°С; оптимум 37°С, желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу, фруктозу, инозит; умеренно - лактозу, арабинозу, рафинозу, слабо - сахарозу, рамнозу, ксилозу, не использует маннит, галактозу и целлюлозу.

Антагонистические свойства.

При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и грамотрицательных бактерий Bacterium paracoli, Commomonas terrigena, дрожжей Saccharomyces cerevisiae; не действует на Escherichia coli. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.

Штамм ВКПМ-S1086 поясняется следующим примером.

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S1086, выращенной в течение (7-10) суток на овсяной агаровой среде, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл) и выращивают (18-24) часа при 37°С на качалке при (220-240) об/мин. Состав посевной среды, %:

Глюкоза 1,0 Соевая мука 2,0 Крахмал 2,0 Натрий хлористый 0,3 Мел 0,3 Вода Водопроводная рН до стерилизации 6,8

Выросшим мицелием в количестве (3-5) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл) следующего состава, %:

Концентрат кормовые дрожжи 4,0 Цинк сернокислый 0,1 Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,3 Вода Водопроводная рН до стерилизации 6,8

Ферментацию проводят на качалке при (200-220) об/мин, 28°С в течение 144 ч. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом тонкослойной хроматографии с биологическим проявлением по Bacillus subtilis ATCC 6633. Содержание блеомицетина (блеомицина А₅) в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации составляет 120 мкг/мл.

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является более высокое содержание антибиотика блеомицетина в культуральной жидкости, а именно в штамме-прототипе 70 мкг/мл, в заявленном штамме 120 мкг/мл.

Известен способ получения блеомицетина на основе штамма ИНА-1706. Этот способ основан на выделении блеомицетина из нативного раствора с рН 5,5 на катионите КБ-2 (Na⁺) с последующей промывкой смолы 0,5 М раствором уксусной кислоты и десорбцией антибиотика 0,25 н.раствором соляной кислоты. Дальнейшая очистка проводится методом хроматографии на колонке с катионитом КБ-2 (Na⁺), используя для вытеснения 0,15 М водный буферный раствор уксуснокислого аммония с рН 6,5, с последующим выделением блеомицина А5 из буферного раствора сорбцией на КБ-2, элюцией 0,25 н. раствором HCl и осаждением блеомицетина (блеомицина А5) ацетоном из водно-метанольного раствора при рН (4,0-4,5).

Известный способ имеет ряд недостатков - это невысокий выход (не более 50%-ов) целевого продукта, кроме того, известный способ не позволяет полностью освободиться от минорных, содержащихся в следовых количествах компонентов - блеомицинов группы В, а также от окрашенных примесей.

Сущность изобретения состоит в том, что блеомицетин выделяют из культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза штамма-продуцента ВКПМ-S1086, сорбцией на карбоксильной смоле КБ-2 в солевой форме. Смолу промывают 0,5 М раствором уксусной кислоты и антибиотик десорбируют 0,25 н. раствором соляной кислоты. После повторной сорбции на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме блеомицетин элюируют 0,15 молярным водным буферным раствором уксуснокислого аммония с рН 6,5. Обессоленный обрабатывают сорбентом «Стиросорб MN-200» в статических условиях из расчета не менее 5 мл адсорбента на 1 г антибиотика и оставляют не менее чем на 1 час при частом перемешивании для установления равновесия.

Раствор отделяют от адсорбента. Адсорбент многократно промывают небольшими порциями воды. Промывку адсорбента прекращают, когда поглощение при λ_max=290 нм в растворе снизится до 2% от исходного.

Первые, наиболее концентрированные промывки присоединяют к общему раствору, последующие используют для промывки обеззоливающих смол.

Обеззоленный раствор антибиотика при рН=(6,0-7,0) упаривают в вакууме при температуре не более 45°С, остаток растворяют в 90% метаноле, устанавливают рН в пределах (3,7-4,4) добавлением раствора HCl и осаждают 7-кратным объемом ацетона.

Общий выход блеомицетина не менее 70%. На «Стиросорбе MN-200» адсорбируются преимущественно блеомицины группы «В» (В-2, В-4) и окрашенные примеси, блеомицин А-5 (блеомицетин) практически не адсорбируется.

Способ поясняется следующим примером:

Пример 2.

Блеомицетин выделяют из культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза штамма-продуцента ВКПМ-S1086, сорбцией на карбоксильной смоле КБ-2 в солевой форме. Смолу промывают 0,5 М раствором уксусной кислоты и антибиотик десорбируют 0,25 н. раствором соляной кислоты. После повторной сорбции на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме блеомицетин элюируют 0,15 молярным водным буферным раствором уксуснокислого аммония с рН 6,5. Элюат обрабатывают сорбентом «Стиросорб MN-200» в статических условиях из расчета не менее 5 мл адсорбента на 1 г антибиотика и оставляют не менее чем на 1 час при частом перемешивании для установления равновесия.

Раствор отделяют от адсорбента. Адсорбент многократно промывают небольшими порциями воды, оставляя каждую из них в контакте с адсорбентом на (10-20) мин. Промывку адсорбента прекращают, когда поглощение в растворе снизится до 2% от исходного.

При обработке «Стиросорбом MN-200» рН раствора не изменяется (рН=6,0). Для удаления минеральных катионов (блеомицетин осаждают при рН 3,7-4,4) раствор пропускают через столб катионита КУ-2-20 в [H⁺] (К_наб.=1,5) из расчета 3 г антибиотика (30000 ед. поглощения) на 1 г смолы (1,5 мл). Смолу промывают водой. Вытекающий с колонки раствор имеет рН≤4,0. Его нейтрализуют небольшим количеством анионита ЭДЭ-10П [ОН^-] до рН=(6,0-7,0) и упаривают в вакууме (при 45°С). Остаток растворяют в 90% метаноле из расчета 100 мг (100 ед. поглощения) в 1 мл, устанавливают рН в пределах (3,7-4,4) добавлением раствора HCl и осаждают 7-кратным объемом ацетона. Потери антибиотика на КУ-2-20 и анионите ЭДЭ-10П составляют не более (2-3)%.

Общий выход блеомицетина не менее 70%.

Блеомицетин (блеомицин А5), полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-1086, представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, метаноле, ограниченно - в этаноле и нерастворим в других органических растворителях. По физико-химическим свойствам, антибактериальной и противоопухолевой активности и токсичности полностью соответствует требованиям ФС. Брутто-формула: C₅₇H₈₉N₁₉O₂₁S₂.4HCl. Мол. масса 1586,4 а.е.м.

УФ-спектр: λ_max (вода) нм (Е^1% _{1 см}) 290 (108);

Мол. масса основания (метод MALDI-MS)=1441 (М+2Н) и 1463 (M+Na⁺+H);

ИК-спектр (KBr), λ_max, см^-1: 3346; 2920; 1654; 1550; 1444; 1397; 1330; 1258; 1057; 969; 881;811; 776; 738; 625.

Использование нового сорбента «Стиросорба MN-200» считаем существенным, поскольку именно он приводит к повышению выхода целевого продукта и улучшению его качества.

Высокая антибиотическая активность нового штамма Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S1086 (в 1,8 раза превышающая активность штамма прототипа ИНА №1706) определяет перспективность его использования в промышленном производстве блеомицетина.

Таблица 1 Культурально-морфологические признаки штамма Агаровая среда Рост воздушного мицелия Цвет мицелия Растворимый Воздушного Субстратного Пигмент №1 Гаузе ++ Белый (Д3) до розоватого (Г2) Бесцветный до буроватого (Б4) Нет Овсяная +++ Белый до желтоватого (Ж6) Желтоватый (Ж6) до желтовато-бурого (д4) Слабый буроватый (б5) Чапека +- Белый (Д3), позднее розоватый (Г2) Бесцветный Нет Глюкозо-аспарагиновая +++ Белый (Д3) до розоватого Желтовато-буроватый(д4) Нет Линденбайна (глицерин-нитратная) ++ Белый (Д3), позднее желтоватый (Ж6) Желтовато-буроватый(д4) Слабый, буроватый (б5) Глюкозо-нитратная №2 Гаузе ++ Белый (Д3) до розоватого (Г2) Буровато-желтоватый (б4) Слабый, буровато-желтоватый Третнера (с пептоном и лимонно-кислым железом) +- Белый (Д3) Бесцветный Нет */+++ - хороший; ++ - умеренный; + - слабый.

Источники информации

1. Зенкова В.А. и др. Антибиотики, №3, 175-179 (1979).

Изобретение относится к новому штамму-продуценту антибиотика блеомицетина и его использованию в биосинтезе противоопухолевого антибиотика блеомицетина гидрохлорида, используемого при лечении плоскоклеточного рака. Штамм-продуцент Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S1086 получен в результате индуцированного мутагенеза с последующим отбором вариантов на селективных средах, содержащих стрептомицин и ванкомицин. Полученный штамм 10007 депонирован в ВКПМ под номером S1086 и продуцирует блеомицетин в 1,8 раз больше, чем исходный штамм. Антибиотик блеомицетин получают из культуральной жидкости продуцента с использованием карбоксильного катионита КБ-2 и очисткой на нейтральном гидрофобном сорбенте "Стиросорб MN-200». Фильтрация раствора антибиотика на колонке с сорбентом "Стиросорб MN-200» позволяет сорбировать примеси и не сорбировать антибиотик, повышает до 70% выход антибиотика с содержанием активного вещества до 97%. Использование на этой стадии воды позволяет получать высокоочищенные бессолевые препараты блеомицетина гидрохлорида. Использование изобретения позволяет повысить выход антибиотика до 70% с содержанием активного вещества до 97%. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S1086 - продуцент антибиотика блеомицетина.

2. Способ получения антибиотика блеомицетина путем биосинтеза штамма-продуцента, сорбции антибиотика из нативного раствора, элюции антибиотика с последующим его выделением, концентрацией и осаждением, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S1086, сорбцию примесей проводят на сорбенте "Стиросорб MN-200", раствор антибиотика обеззоливают, концентрируют и осаждают ацетоном в форме гидрохлорида.