СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРАТВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/483 G01N24/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии и может быть использовано для определения нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости.

Известен способ определения нитратвосстанавливающей способности слюны, включающий забор пробы, разбавление ее дистиллированной водой, добавление 1% реактива Грисса, приготовленного на 20%-ной уксусной кислоте, инкубирование на кипящей водяной бане в течение 5 мин, центрифугирование при 12000 об/мин, колориметрирование надосадка при 540 нм и определение фонового уровня нитритов по калибровочной кривой. Определение активности нитратредуктазы проводилось путем инкубации образцов слюны с нитратом натрия в течение 30-60 мин при 37^oC, добавления реактива Грисса и калориметрирования. Прирост нитрита определяют по сравнению с фоновым уровнем. /Храмов В.А. Нитратредуктазная активность слюны человека//Вопросы питания, 1992, N 5-6, с.65/.

К недостаткам данного способа относится многоэтапность, и, следовательно, большое количество времени, необходимое для проведения анализа, использование дорогостоящих химических реактивов.

Также известен другой способ определения нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости, а именно-желудочного содержимого. Известный способ заключается в заборе пробы, центрифугировании, замораживании в жидком азоте с последующей ЭПР-спектроскопией, при которой регистрируют сигнал, образующийся при взаимодействии гемсодержащих групп с окисью азота /МПК G 01 N 33/48; А.с. N 1529115/.

К недостаткам данного способа следует отнести возможное искажение результатов за счет быстрого окисления железа гемсодержащих групп до трехвалентного состояния, что приводит к исчезновению парамагнитных свойств данных комплексов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости путем исследования активности нитратредуктазы.

Известный способ включает определение фонового уровня нитритов в смешанной слюне путем добавления 0,6%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 20%-ном растворе соляной кислоты и 0,1%-ного раствора N-1-нафтилэтилендиамина, инкубации в течении 10 мин при комнатной температуре, 15-ти минутного центрифугирования при 3000 об/мин и колориметрирования на спектрофотометре при длине волны 548 нм. Количество нитритов расчитывают по калибровочной кривой. Полученные результаты являются контролем.

Определение активности нитратредуктазы проводят следующим образом. В инкубационную смесь, содержащую слюну, дитионит, метилвиологен, фосфатный буфер добавляют нитрат натрия, инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, после чего разбавляют дистиллированной водой и добавляют реактивы на нитриты. По результатам спектрофотометрии расчитывают активность нитратредуктазы, которую выражают в микромолях нитрита, образовавшегося за 1 мин в 1 л слюны. Расчет проводят по формуле: где C_o-количество нитритов (в мкмоль на 1 л), определяемое после инкубации; C_исход-исходное количество нитритов; Т-время инкубации; V-объем слюны в пробе. /Вавилова Т.П., Петрович Ю. А. Определение активности нитратредуктазы в смешанной слюне.//Вопросы медицинской химии, 1991, том. 37, N 2, с.69/.

Недостатком данного способа, как и аналогичного, связанного со спектрофотометрией, является недостаточная точность определения, так как возможно искажение результатов за счет мутности исследуемой смеси, обусловленной присутствием белков.

Кроме этого, известный способ также многоэтапен и, как следствие, требует большого количества времени на исследование. Способ предполагает использование дорогостоящих реактивов, многие из которых зарубежного производства.

Задачей предлагаемого решения является разработка способа, позволяющего оценить нитратвосстанавливающую способность любой биологической жидкости.

Техническим результатом настоящего предложения является повышение точности определения за счет обеспечения стабильности получаемых результатов при исследовании любой биологической жидкости, а также сокращения времени определения.

Технический результат обеспечивается путем взятия пробы, разделения ее на контрольную и опытную части, внесения в опытную часть нитрата натрия с последующей ее инкубацией. Затем в обе части пробы вводят химические реагенты и определяют содержание нитрита по калибровочной кривой в каждой части пробы отдельно. По сравнению полученных результатов судят о нитратвосстанавливающей способности.

Новым в предлагаемом способе является использование в качестве химических реагентов кристаллических гипосульфита натрия, сернокислого железа и аскорбата натрия.

Отличительными приемами предлагаемого способа являются замораживание образца реакционных смесей в жидком азоте и определение концентраций нитрита в них ЭПР-спектроскопией.

Использование кристаллического гипосульфита натрия и кристаллического сернокислого железа позволяет получить в реакционной смеси железосерные группы. Кристаллический аскорбат натрия восстанавливает содержащийся в пробе нитрит до окиси азота, которая соединяется с железосерными группами и образует парамагнитный комплекс, дающий характерный сигнал с g-фактором 2,03 (сигнал 2,03), регистрируемый ЭПР-спектроскопией.

Повышение точности определения в предлагаемом способе достигается обеспечением условий создания парамагнитных комплексов.

Использование ЭПР-спектроскопии позволяет повысить чувствительность определения, поскольку данный метод обладает высокой разрешающей способностью и специфичностью, так как получаемый (регистрируемый) сигнал 2,03 присущ только окиси азота, соединенной и железосерными группами.

Минимальная концентрация нитрита, определяемая предлагаемым способом составляет 0,003 ммоль/л.

Добавление указанных реактивов в обе части пробы дает возможность получить сигнал 2,03 в них. Сопоставление амплитуд зарегистрированных сигналов и определение концентрации нитрит-иона по калибровочным кривым позволяет получить численные значения содержания нитрита, сравнить их и сделать вывод о нитравосстанавливающей способности исследуемой жидкости.

Если концентрация нитрита возросла менее чем в 5 раз, то нитратвосстанавливающая способность слабая; в 5-15 раз - умеренная; более, чем в 15 раз - сильная. Нитратвосстанавливающая способность отсутствует, если концентрация нитрита в опытной пробе не увеличилась.

Из приведенного выше сопоставительного анализа следует, предлагаемый способ соответствует критерию "новизна".

Способ, воплощающий изобретение при его осуществлении, предназначен для использования в здравоохранении. Независимым пунктом формулы подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке приемов и средств. Способ, воплощающий изобретение при его осуществлении, способен обеспечить достижение усматриваемого заявителем технического результата. Следовательно, рассматриваемый способ соответствует критерию изобретения "промышленная применимость".

При анализе известных способов определения нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости было выявлено в них отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков способ на достижение технического результата, что дает возможность сделать вывод о соответствии изобретения требованию "изобретательский уровень".

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

Полученную на исследование биологическую жидкость в количестве 3-5 мл разделяют на две части: контрольную и опытную, каждая по 1,5-2 мл. В контрольную часть образца вносят 10-20 мг гипосульфита натрия, 3-10 мг сернокислого железа и 20-30 мг аскорбата натрия. Вещества вносят в избытке в кристаллической форме. Выдерживают при комнатной температуре до их полного растворения 3-5 мин. После чего образец насасывают в стеклянную трубочку с внутренним диаметром 4 мм и замораживают в жидком азоте. Замороженный образец помещают в кварцевый сосуд Дьюара, устанавливают в резонаторе ЭПР-спектрометра и проводят запись сигнала 2,03. Запись осуществляют при следующих показателях: мощность СВЧ-излучение (P)= 10 дБ, развертка магнитного поля (N_H)=320 мТ, высокочастотная модуляция 0,5 мТ, постоянная времени 0,3 с.

В опытную часть пробы добавляют 10-20 мг кристаллического нитрата натрия, инкубируют в течение 30 мин при 37^oC, после чего вносят гипосульфит натрия, сернокислое железо и аскорбат натрия в том же количестве, что и в контрольную пробу. Аналогично контрольному образец замораживают и записывают сигнал 2,03.

При сравнении амплитуд зарегистрированных сигналов контрольной и опытной частей пробы делают вывод о нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости. Количественную оценку содержания нитрита в пробе производят по калибровочной кривой.

Пример 1. У испытуемого Е., не имеющего паталогии желудочно-кишечного тракта и челюстно-лицевой системы, собирают слюну в количестве 3 мл. В другую пробирку вносят 5 мг кристаллического гипосульфита натрия, 2 мг кристаллического сернокислого железа и 10 мг кристаллического аскорбата натрия. Затем к этим веществам добавляют 1/2 часть пробы -1,5 мл слюны, в которой они растворяются. Из полученной смеси приготавливают образец для исследования путем насасывания в стеклянную трубочку с внутренним диаметром 4 мм. Образец замораживают в жидком азоте, выдавливают из трубочки, помещают в кварцевый сосуд Дьюра и записывают спектр ЭПР. В слюне регистрируют сигнал 2,03. Содержание нитрита, определенное по калибровочной кривой было 0,004 ммоль/л. В третью пробирку, куда предварительно было внесено 15 мг кристаллического нитрата натрия добавляют 1,5 мл оставшейся слюны и инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, после чего аналогично вышеописанному добавляют кристаллические гипосульфит натрия, сернокислое железо и аскорбат натрия. После их растворения приготавливают образец, замораживают и исследуют методом ЭПР. Содержание нитрита в данной опытной части пробы, определенное по калибровочной кривой, составило 0,15 ммоль/л. Увеличение концентрации нитрита произошло в 37,5 раз. Сделано заключение, что нитратвосстанавливающая активность данной слюны сильная.

Пример 2. У практически здорового испытуемого З. аналогично примеру 1 была собрана слюна, исследовано содержание нитритов, которое составило 0,1 ммоль/л, после инкубации с нитратом натрия концентрация нитритов была 0,14 ммоль/л. Увеличение в 1,4 раза, что свидетельствует о слабой нитратвосстанавливающей активности слюны.

Пример 3. У здоровой испытуемой П. концентрация нитрита в слюне составила 0,019 ммоль/л, а после инкубации-0,1 ммоль/л. Увеличение составило 5,2 раза, следовательно нитратредуктазная активность слюны средняя.

Пример 4. У практически здорового испытуемого С. пункцией локтевой вены взята кровь и отцентрифугирована в течении 10 мин при 3000 об/мин для получения сыворотки. Сыворотка в количестве 2 мл была разделена на две части. Одну из частей инкубировали с 15 мг кристаллического нитрата натрия в течение 30 мин при 37^oC, а затем к ней добавили кристаллические гипосульфит натрия, сернокислое железо и аскорбат натрия; вторую часть сыворотки соединили с последними веществами без инкубации ее с нитратом натрия. При ЭПР-спектроскопии образцов, сделанных из этих реакционных смесей, сигнал 2,03 не регистрировался ни в одном из них. Сделано заключение, что в сыворотке крови нитриты не содержатся и нитратредуктазная активность отсутствует.

Всего было проведено 18 исследований образцов биологических жидкостей на их нитратвосстанавливающую активность. Среди биологических жидкостей были апробированы слюна (17 образцов) и сыворотка крови (1 образец).

Получены следующие результаты: в 3-х нитратвосстанавливающая активность отсутствовала, нитратвосстанавливающая способность имелась в 83,3% исследованных образцов, из них сильная 22,2%, средняя 33,3%, слабая 27,7%.

Таким образом предлагаемый способ позволяет быстро, качественно, достоверно и недорого оценить нитратвосстанавливающую способность любых биологических жидкостей. Способ может быть использован в клинике при диагностике и оценке эффективности лечения ряда нозологических форм и патологических состояний.

Изобретение - cпособ определения нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости - относится к медицине, а именно к клинической биохимии. Техническим результатом предложенного способа является повышение точности определения и сокращение времени исследования. Способ определения нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости включает забор пробы, разделение на опытную и контрольную части, внесение в опытную часть нитрата натрия, инкубацию, введение в обе части пробы химических реагентов и определение содержания нитрита по калибровочной кривой с последующим сравнением данных опытной и контрольной частей пробы. Новым в способе является использование в качестве химических реагентов кристаллических гипосульфита натрия, сернокислого железа и аскорбата натрия. Полученные реакционные смеси замораживают в жидком азоте. Отличие способа заключается в том, что концентрацию нитрита определяют ЭПР-спектроскопией.

Способ определения нитратвосстанавливающей способности биологической жидкости, включающий забор пробы, разделение на опытную и контрольную части, внесение в опытную часть нитрата натрия, инкубацию, введение в обе части пробы химических реагентов и определение содержания нитрита по калибровочной кривой с последующим сравнением данный опытной и контрольной частей пробы, отличающийся тем, что в качестве химических реагентов используют кристаллические гипосульфит натрия, сернокислое железо и аскорбат натрия, полученные реакционные смеси замораживают в жидком азоте, концентрацию нитрита определяют ЭПР-спектроскопией.