СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к бактериологии, и может быть использовано для идентификации микробактерий туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis).

Известны различные способы диагностики туберкулеза, включающие выявление микробактерий туберкулеза (МБТ) в патологическом материале.

Известен способ обнаружения МБТ путем прямой бактериоскопии (см. Перельман М. И. , Корякин В.А. и Протопопова И.М. Туберкулез. М.: Медицина, с. 32-33). Для этого на обезжиренное стекло наносят каплю физиораствора и мокроту больного, которые тщательно растирают до однородности. Высушивают, фиксируют спиртом и красят фуксином Циля-Нильсена. Препарат микроскопируют. МБТ окрашиваются в красный цвет, а окружающий фон - в синий.

Также известен и бактериологический способ диагностики туберкулеза, включающий посев исследуемого материалa на питательную среду Левенштейна-Йенсена. Культивирование проводят в течение 14-90 дней (см. Перельман М.И., Карякин В.А. и Протопопова И.М. Туберкулез. М.: Медицина, с. 32-33). Затем культуру пересевают на глицериновые среды, инкубируют с последующей обработкой кислотами и щелочами. В заключение проводят пробу на устойчивость - мазки опускают в растворы: 1 - серной кислоты, 2 - едкого калия (натрия), 3 - жавелевой воды. После чего мазки докрашивают и микроскопируют.

По наличию в микроскопической картине бесцветных продолговатых и морщинистых палочек микобактерий туберкулеза диагностируют туберкулез.

К недостаткам данных способов следует отнести низкую чувствительность методов и длительные сроки постановки диагноза, обусловленные культивированием бактерий.

Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому является способ диагностики туберкулеза путем обнаружения туберкулостеариновой кислоты, являющейся биомаркером микобактерий туберкулеза (J, Clin. Investig., v. 63, N 5, 1979, p. 813-819).

Известный способ осуществляют следующим образом.

2-4 мл мокроты больного обеззараживают автоклавированием (при 121^оС в течение 60 мин при Р = 1,1 кр/см²), обрабатывают 5 мл 3%-ного водного раствора лаурилсульфата и 1%-ным раствором гидроксида натрия при перемешивании в течение 20 мин. Полученную смесь центрифугируют при 3 тыс. оборотов в мин в течение 30 мин, рН раствора доводят серной кислотой до 7,0 и лиофилизируют. Затем образцы переносят в 2-миллилитровую стеклянную ампулу и экстрагируют в течение ночи смесью хлороформ - метанол (2 : 1, V/V) при комнатной температуре. После центрифугирования в течение 20 мин при 4000 об/мин супернатант переносят в новую ампулу и концентрируют досуха в токе азота. После чего приливают 1 мл 3%-ного метанольного раствора хлористого водорода и ампулу запаивают. Метанолиз проходит при 80^оС в течение 20 ч, по окончании ампулу центрифугируют при 4000 об/мин 20 мин. Супернатант упаривают досуха в токе азота и добавляют 100 мл н-гексана. Полученную смесь обрабатывают в ультрасониковой бане 1 мин при 125 В, затем раствор анализируют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Условия TCX: пластины приготавливают нанесением слоя 0,25 мм силикагеля (Silicagel Go F 254, Merсk A.G., Darmstadt, Germany). В качестве растворителя используют смесь н-гексана и диэтилового эфира (9 : 1). Через 30-40 мин пятно, соответствующее метиловому эфиру, соскабливают с пластины и экстрагируют этилацетатом. Перед инжекцией в газохроматографическую колонку образец был упарен досуха и растворен в гексане.

Образец снимали на приборе: масс-спектрометр (Varian Assaciatis, Instrument Dis, Palo Alto, Calif, MaT model 112), соединенный с газовым хроматографом (Varian. Associates, model 112).

Условия хроматографирования следующие: стеклянная колонка, вн. диаметр 2 мм, заполненная 3,7% ОУ-17 на хромосорбе W, HP 80/100 меш, длина колонки - 3 м. Температура инжектора - 270^оС, температура печи - 230^оС. Газ-носитель - гелий, его скорость - 20 мл/мин. Условия работы масс-спектрометра следующие. Температура сепаратора - 250^оС, температура ионного источника - 230^оС, энергия электронов 70 еВ. Измерение проводили при детектировании по одному иону, соответственно по 312 m/z (молекулярный ион) и по 167 m/z. По наличию в полученном масс-спектре характерного молекулярного иона туберкулостеариновой кислоты диагностируют туберкулез. Общее время анализа составляет 4 сут. К недостаткам данного способа следует отнести длительность и многоэтапность операций, предшествующих хромато-масс-спектрометрическому исследованию пробы.

Целью предлагаемого способа диагностики является сокращение времени определения и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что способ диагностики туберкулеза проводят путем забора пробы, ее автоклавирования, экстракции хлороформ-метанольной смесью, упаривания, метилирования, растворения в гексане и хромато-масс-спектрометрического определения туберкулостеариновой кислоты.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что отличительными признаками заявляемого способа являются: отделение органического слоя после проведения экстракции, его высушивание над безводным сульфатом натрия и проведение метилирования при температуре кипения метилирующей смеси в течение 15-20 мин.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения "новизна".

Сравнение заявляемого решения с другими техническими решениями показывает, что прием отделения органического слоя от водной фазы образца является широко используемым в органической химии, так же как и удаление следов воды из органического экстракта с помощью безводной соли Na₂SO₄.

Однако указанные приемы не использовались ранее для подготовки безводного образца к хромато-масс-спектрометрическому анализу. Введение данных приемов в заявленный способ позволило исключить технически сложный прием - лиофильную сушку биосубстрата и тем самым сократить общее время анализа на 4-6 ч.

Авторами заявляемого способа экспериментальным путем установлено, что в предлагаемом способе процесс метилирования происходит за 15-20 мин. Необходимым условием является проведение этой реакции при температуре кипения метилирующей смеси (t = 65-70^оС) в колбе с обратным холодильником. Данный прием позволяет сократить время диагностики на сутки, поскольку в известном способе процесс метилирования идет в течение 20 ч (при t = 80^оС).

Таким образом, авторами заявляемого способа диагностики установлено новое свойство анализируемой смеси - процесс метилирования происходит за 15-20 мин, что позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию "существенные отличия".

Заявленный способ диагностики туберкулеза осуществляют следующим образом.

Для анализа забирают от 2 до 10 мг биосубстрата-мокроты, содержимого плевральной полости или дренажной жидкости. Биосубстрат автоклавируют при температуре 121^оС в течение 60 мин, к нему добавляют 5 мл гидроксида натрия (4%), встряхивают 10 мин, нейтрализуют разбавленной H₂SO₄ до рН 7,0 и заливают экстрагирующей смесью - хлороформ : метанол, взятых в соотношении 2 : 1. Соотношение биосубстрата и экстрагента составляет 1 : 1. Экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 20 ч. Затем смесь центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, отделяют нижний органический слой, который высушивают над Na₂SO₄(безводным). После чего экстракт отфильтровывают от Na₂SO₄ и упаривают досуха в токе азота. Остаток метилируют в 3%-ном растворе HCl в метаноле при температуре кипения 65-70^оС в течение 15-20 мин. Затем раствор упаривают в токе азота, остаток растворяют в 10 мл гексана и анализируют на хромато-масс-спектрометре (ХМС) методом селективного ионного детектирования (SIM) при m/z 312 и записи полного масс-спектра метилата С₁₉ кислоты. Основные фрагментарные ионы масс-спектра туберкулостеариновой (TbS) кислоты: (m/z) 312, 269, 199, 171, 167, 149, 141, 113.

ХМС-анализ выполняют на приборе хромато-масс-спектрометре фирмы LKB 20-91 с ЭВМ РДП1134. Условия хроматографирования: стеклянная капиллярная колонка (l = 25) с неподвижной жидкой фазой SE-30; температура инжектора - 350^оС; температура термостата - 140 ->> 320^оС, 4'/мин; газ-носитель - Не, V_He - 20 мл/мин.

Условия снятия масс-спектра: температура сепаратора - 320^оС; температура ионного источника - 320^оС; энергия ионизирующих электронов - 70 еВ. Ионный ток записывали по одному иону - m/z 312, т.е. в режиме селективного ионного детектирования. Минимальная определяемая концентрация TbS кислоты в образце составляла 100 мг/мл. Общее время анализа занимало 2 сут.

П р и м е р 1. Взята на исследование мокрота от больного Г., поступившего в гнойное отделение центра хирургической инфекции с предварительным диагнозом - гангрена легкого (N истории болезни 5850, дата взятия анализа 20.12.90). 10 мл мокроты автоклавировали при 121^оС 30 мин, Р = =1,1 кР/см². К обеззараженному биосубстрату добавили 5 мл 4%-ного раствора NaOH, содержимое встряхивали в течение 10 мин, затем нейтрализовали разбавленной H₂SO₄ до рН 7,0 и заливали экстрагентом хлороформ-метанол (2 : 1) в количестве 15 мл и оставляли на ночь при комнатной температуре. После центрифугирования отделяли нижний органический слой и высушивали его над безводным Na₂SO₄ в течение 20 мин. Отфильтровывали экстракт от Na₂SO₄ и упаривали досуха в токе азота. Сухой остаток метилировали 3%-ным раствором соляной кислоты в метаноле, приготовленном добавлением 5 мл хлористого ацетила к 100 мл сухого МеОН. Метилирование проводили десятью мл метилирующего агента при нагревании до температуры кипения (с обратным холодильником) в течение 15 мин. Метилированный продукт упаривали в токе азота досуха, остаток растворяли в 100 мкл гексана и анализировали на хромато-масс-спектрометре фирмы IKB 2091 с ЭВМ РДП-1134 с использованием стеклянной капиллярной колонки l = 25 м с неподвижной жидкой фазой SE-30. Хроматографирование проводили при температуре 140-320^оС, 4^о/мин; газ-носитель Не; температура инжектора - 350^оС; температура ионного источника - 320^оС; температура сепаратора - 320^оС; энергия ионизирующих электронов - 70 еV. Запись масс-спектра ТBS кислоты вели при максимальной интенсивности 1357. В результате проведенного анализа установлено присутствие туберкулостеариновой кислоты в образце.

П р и м е р 2. Проведен забор мокроты от больного С. с предварительным диагнозом двухсторонняя абсцедирующая пневмония (N истории болезни 1899). 10 мл мокроты автоклавировали (121^оС, 30 мин, Р = 1,1 кр/см²) с добавлением к ней 5 мл 4%-ного водного раствора NaOH, содержимое встряхивали 10 мин, раствор нейтрализовали разбавленной H₂SO₄до рН 7,0 и заливали экстрагентом хлороформ-метанол (2 : 1, V/V) в количестве 15 мл и оставляли на ночь при комнатной температуре. После центрифугирования отделяли нижний органический слой и высушивали его над 15 г безводной NaSO₄ в течение 20 мин. Экстракт отфильтровывали и упаривали досуха в токе азота. Сухой остаток метилировали 3%-ным раствором HCl в метаноле. Метилирование проводили 10 мл метилирующего агента при нагревании до температуры кипения (с обратным холодильником) в течение 20 мин. Прометилированный продукт упаривали в токе азота досуха, остаток растворяли в 100 мкл гексана и анализировали на хромато-масс-спектрометре (условия ХМС-анализа приведены выше). Запись масс-спектра в интервале выхода TbS кислоты проводили при интенсивности 2857. Туберкулостеариновой кислоты не обнаружено.

Из представленных материалов следует, что заявленный способ позволяет в 2 раза сократить общее время проведения анализа (2 сут вместе 4 по способу-прототипу) и значительно упростить его за счет исключения приемов лиофилизации. Для наглядного выявления различий сравниваемых технических решений приведен их сопоставительный анализ:
Известный способ 1. Взятие биопробы (мокрота) 2. Автоклавирование пробы при 121^оС в течение 60 мин 3. Обработка 3%-ным водным раствором лаурилсульфата и 1% -ным водным раствором гидроксида натрия при перемешивании в течение 20 мин 4. Центрифугирование при 3 тыс. об. в мин в течение 30 мин. 5. Доведение рН до 7,0 (с использованием серной кислоты) 6. Лиофилизация 7. Экстракция смесью хлороформ - метанол (1 : 1) в течение 20 ч 8. Центрифугирование при 4 тыс. об. в мин в течение 20 мин 9. Концентрация в токе азота (досуха) 10. Добавление 1 мл 3%-ного метанольного раствора кислоты 11. Метанолиз при 80^оС в течение 20 ч 12. Центрифугирование при 4 тыс. об. в мин в течение 20 мин 13. Упаривание супернатанта в токе азота 14. Добавление 100 мл н-гексана 15. Обработка смеси в ультрасониковой бане в течение 1 мин при 125 В 16. Анализ методом тонкослойной хроматографии на силикагеле, элюент н-гексан - диэтиловый эфир (9 : 1) 17. Соскабливание пятна через 30-40 мин, соответствующего метиловому эфиру и экстрагирования его этилацетатом 18. Упаривание досуха 19. Растворение в гексане 20. Анализ на хромато-масс-спектрометре 21. Условия хроматографирования: стеклянная колонка, l = 3 м, внутренний d = 2 мм, заполненная 3,7% ОУ-17 на хромосорбе WHP 80/100 меш,
t инжектора = 270^оС.

t термостата = 230^оС,
газ-носитель - гелий,
V_He = 20 мл/мин 22. Условия работы масс-спектрометра:
t сепаратора = 250^оС,
t ионного источника = 230^оС,
Е = 70 эВ, измерение проводили при селективном детектировании по ионам m/z 312 и 167.

Общее время анализа - 4 сут
Заявляемый способ 1. + 2. + 3. Обработка 4%-ным водным раствором гидроксида натрия, встряхивание в течение 10 мин 4. - 5. + 6. - 7. +, соотношение растворителей 2 : 1, соотношение экстракта и экстрагента 1 : 1, + 8. +, при 3 тыс. об. в мин в течение 15 мин, отделение нижнего органического слоя, его высушивание над безводным сульфатом натрия, фильтрование 9. + 10. + 11. +, при 65-70^оС в течение 15-20 мин 12. - 13. + 14. +, 10 мл н-гексана 15. - 16. - 17. - 18. - 19. - 20. + 21. Условия хроматографирования: стеклянная капиллярная колонка, l = 25 м, заполненная 5% SE-30 на хромосорбе,
t инжектора 350^oС,
t термостата 140-320^оС, 4^о/мин,
газ-носитель - гелий,
V_He = 20 мл/мин 22. Условия работы масс-спектрометра:
t сепаратора = 320^оС,
t ионного источника = 320^оС
Е = 70 эВ, измерение проводили при селективном ионном детектировании по иону m/z 312.

Общее время анализа - 2 сут
Основными отличительными приемами заявленного способа/ обеспечивающими движение поставленной цели/ являются высушивание органического слоя над безводным сульфатом натрия и проведение процесса метилирования в течение 15-20 мин при 65-70^оС.

Использование: медицина, пульмонология. Цель - сокращение времени определения и упрощение способа. Сущность изобретения: забор пробы мокроты, ее автоклавирование, экстракция хлороформ-метанольной смесью, упаривание, метилирование, растворение в гексене и последующее хроматомасс-спектрометрическое определение туберкулостеариановой кислоты. Отличие способа заключается в отделении органического слоя после экстракции хлороформ-метанольной смесью, в высушивании его над безводным сульфатом натрия и проведение процесса метилирования при температуре кипения метилирующей смеси в течение 15 - 20 мин.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА, включающий взятие пробы мокроты, автоклавирование пробы при 121^oС в течение 60 мин при давлении 1,1 кр/см², экстракцию хлороформ-метанольной смесью, взятой в соотношении 2 : 1, центрифугирование, упаривание супернатанта в токе азота, добавление к высушенному супернатанту 3%-ного метанольного раствора хлористого водорода и инкубацию полученной смеси при 80^oС, повторное центрифугирование и упаривание супернатанта, растворение последнего в гексане с последующим определением туберкулостеариновой кислоты хроматографическим и масс-спектрометрическим методами, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, органический слой отделяют после центрифугирования и перед упариванием его высушивают над безводным сульфатом натрия, а инкубацию проводят при 65 - 70^oС в течение 15 - 20 мин.