СПОСОБ И.К.ТУТОВА И В.И.СИТЬКОВА ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/14 

Изобретение относится микробиологии, а именно к способам получения и применения стимуляторов роста микроорганизмов, и может быть использовано для приготовления препаратов в диагностических, профилактических и лечебных целях.

Известен способ получения стимулятора роста дрожжей, предусматривающий проращивание зерен злаковых пшеницы, водную экстракцию проростков и отделение целевого продукта (см. патент N 2050416, кл. C 12 N 1/16).

Недостатками данного способа являются ограниченность применения и высокая стоимость получения стимулятора.

Известны также способы получения стимуляторов роста микроорганизмов, включающие их культивирование на основе печеночных и казеиново-дрожжевых экстрактов (см. Бошьян Е. Г. , Романова И.В., Школьников Е.Э. Сравнительная оценка питательных сред для культивирования производственных штаммов энтерококков. Экспресс-информация. М., 1987, N 5, с.1 - 3).

Недостатком данных способов является то, что они не универсальны и многокомпонентны.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению и принятым авторами за прототип является способ получения культуральной жидкости (стимулятора роста микроорганизмов) и его применение, предусматривающий культивирование гриба в водном экстракте чая с содержанием сахара и отделение целевого продукта (см. Жуков В.П. Полезный напиток. Приусадебное хозяйство, 1990, N 1, с.37).

Недостатком данного способа является получение нестандартной по своему составу культуральной жидкости, производимой в домашних условиях.

Цель изобретения - повышение качества, стандартность, универсальность применения для многих микроорганизмов, невысокая стоимость получения.

Поставленная цель достигается тем, что культивирование гриба производят в водном экстракте чая с содержанием 10% пищевого сахара с последующим отделением целевого продукта, при этом в воде при температуре кипения экстрагируют в течение 30 мин 1% чая с добавлением пищевого сахара, затем воду охлаждают до 28 - 30^oC, засевают 10%-ной культуральной жидкостью микробной ассоциации гриба и культивирование осуществляют в течение 3 - 4 недель при вышеуказанной температуре. Способ использования стимулятора роста микроорганизмов предусматривает введение его в питательную среду для соответствующего микроорганизма, при этом для роста и размножения возбудителей листериоза стимулятор вводят в дозе 1,5 - 2%, сальмонеллеза - 2 - 3%, возбудителей рожи - 4 - 5%, актинобациллеза - 3 - 4%.

Сущность способа заключается в следующем. Обычную водопроводную воду доводили до кипения. Затем на таком кипятке готовили однопроцентный экстракт чая. Экстрагирование чая проводили в течение 30 мин. К полученному чайному экстракту добавляли 10% сахара и растворяли его. Полученную таким образом среду охлаждали до 30^oC. Затем в нее засевали 10% матровой культуры гриба или вносили в нее тело гриба в количестве 1 г на 100 мл среды. Культивирование гриба осуществляли при температуре 28 - 30^oC в течение трех - четырех недель. Именно в эти сроки в результате саморегулирующей деятельности микрофлоры гриба получается стандартный продукт метаболизма микробной ассоциации.

По окончании срока культивирования гриба использовали его культуральную жидкость как стимулятор роста микроорганизмов, используемых в биологической промышленности для приготовления вакцин с целью профилактики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных.

С целью стандартизации продуктов метаболизма культуральной жидкости гриба на основе чайного экстракта проведены следующие опытные исследования.

Пример 1. Культивирование микробной ассоциации гриба проводили при температуре 18 - 20^oC в питательной среде на основе кипяченой водопроводной воды с содержанием 1% экстракта чая. Пищевой сахар добавляли в концентрациях 1, 2, 5, 10, 15 и 20%. В приготовленную таким образом питательную среду вносили до 10% культуральной жидкости, содержащей естественную ассоциацию микроорганизмов или 1% массы самого гриба. Через каждые трое суток образующееся в виде пленки тело гриба взвешивали. По максимальному весу гриба определяли время окончания его экспоненциального размножения. При этом установлено, что максимальный вес гриба достигался к 18 сут. его культивирования в питательной среде с содержанием 5 - 10% сахара. После 18 сут. масса гриба уменьшалась. Это указывает на переход экспоненциальной фазы размножения гриба в стационарную с последующим постепенным угасанием его жизнедеятельности. При 15% и 20%-ной концентрации сахара в питательной среде наибольшую массу чайный гриб накапливал к 25 сут., и она была ниже на 20% от массы гриба, выращенного в средах с 5 - 10% сахара. Таким образом, высокие концентрации сахара оказывали тормозящее действие на развитие гриба. Кроме того, такие концентрации сахара в среде были экономически не выгодными. Низкие концентрации сахара (1 и 2%) были недостаточными для значительного накопления массы гриба. В связи с этим в последующем культивирование чайного гриба осуществляли в средах с содержанием 5 - 10% сахара.

Пример 2. Культивирование гриба осуществляли в питательной среде с 5 - 10% сахара, но с различными концентрациями экстракта чая - 0,5, 1, 2, 5, 10. Установлено, что инерция к размножению гриба началась с 0,5%-ной концентрации экстракта чая.

В последующем максимальное накопление массы гриба наблюдалось при 1 - 1,5%-ной концентрации в среде чайного экстракта. Так к 10 сут. масса гриба при данных концентрациях чайного экстракта была выше соответственно на 40 - 70%, чем при 0,5%-ном содержании его в среде. Двух - пяти- и десятипроцентные концентрации чайного экстракта оказывали угнетающее действие на развитие гриба. Концентрации экстракта чая менее одного процента являлись недостаточными для накопления большого количества массы гриба. Из этих опытных данных в последующем использовались только 1 - 1,5%-ные концентрации экстракта чая.

Пример 3. С целью выбора оптимальных температур для выращивания гриба осуществляли его культивирование при 18 - 20, 28 - 30 и 36 - 37^oC. В результате установлено, что наибольшая инерция к размножению микробов ассоциации чайного гриба была при его выращивании при температуре 28 - 30 и 36 - 37^oC. Так на четвертые сутки масса гриба при данных температурных режимах была в три раза выше массы гриба, развивающегося при 18 - 20^oC. Однако к 14 - 15 сут. масса гриба бала примерно одинаковой при всех указанных температурных режимах его выращивания, с небольшим превышением его массы, полученной при культивировании гриба при 28 - 30^oC. Исходя из изложенного, видно, что культивирование гриба можно осуществлять при указанных температурных режимах. При этом необходимо исходить из конкретных условий опыта. Для получения стандартной культуральной жидкости культивирование микробной ассоциации гриба предпочтительно осуществлять, как показали опыты, при температуре 28 - 30^oC.

На основании проведенных опытов отработана следующая технология культивирования гриба. Обычную водопроводную воду доводили до кипения. Затем на таком кипятке готовили однопроцентный экстракт чая. Экстрагирование чая проводили в течение 30 мин. К полученному чайному экстракту добавляли 10% сахара и растворяли его. Полученную таким образом среду охлаждали до 30^oC. Затем в нее засевали 10% матровой культуры гриба или вносили 1% массы самого гриба. Культивирование гриба осуществляли при температуре 28 - 30^oC в течение трех - четырех недель. Именно в эти сроки в результате саморегулирующей деятельности микрофлоры получается культуральная жидкость в виде продукта метаболизма микробной ассоциации.

Полученную культуральную жидкость использовали как стимулятор роста микроорганизмов. Опыты проводили на авирулентных штаммах возбудителей листериоза, рожи, сальмонеллеза, используемых для приготовления живых вакцин и на полевых штаммах возбудителя актинобациллеза животных.

Примеры конкретного выполнения применения стимулятора роста микроорганизмов (СРМ).

Пример 4. В лабораторных условиях проводили культивирование листерий штамма АУФ с целью выявления оптимальной дозы СРМ для наибольшего накопления микробной биомассы. С этой целью к основной питательной среде для этого микроба добавляли СРМ в концентрациях 1, 2, 3, 4, 5%. Питательную среду разливали в пробирки в объеме по 5 мл и после стерилизации среды в нее засевали по 0,1 мл суточной культуры листерий. Культивирование листерий проводили при температуре 37^oC в течение суток. После этого культуру листерий центрифугировали и определяли общую биологическую массу выросших микробов путем взвешивания осадка на торзионных весах. Контролем служили пробирки с выросшими культурами листерий в питательных средах без стимулятора.

В результате лабораторных опытов, проведенных с семикратной повторностью, установлено, что наибольшее накопление биомассы листерий было в средах с двумя и тремя процентами СРМ. В таких средах накопление листерий было на 35 - 42% выше, чем в средах с 1, 4 и 5% стимулятора.

Пример 5. Результаты лабораторных испытаний СРМ позволили провести комиссионную проверку его ростстимулирующих свойств на листерий при выращивании их в промышленных условиях в одном из цехов Ставропольской биофабрики. В производственную питательную среду добавляли 2% СРМ. Культивирование листерий осуществляли в биоферментерах емкостью 500 л по существующей технологии. Культивирование листерий проводили в сравнении с ростом и размножением их в производственной среде со стимулятором роста и в среде той же серии, но без стимулятора. Всего проведено семь опытов (см. акт проверки от 24 января 1996 года).

Установлено, что при выращивании листерий на средах с добавлением СРМ обеспечивается накопление общей биологической массы данного микроба и количества живых микробных клеток на 36% больше, чем при выращивании их на производственных средах без стимулятора. Кроме того, сохраняемость живых микробных клеток после лиофильной сушки листерий была на 10 - 20% выше при выращивании их на средах со СРМ, чем в средах без стимулятора.

На основании приведенного можно сделать вывод, что СРМ обеспечивает не только более высокое накопление общей биомассы и количества живых листерий, но и повышает их резистентность при лиофильной сушке.

Пример 6. В лабораторных условиях культивировали авирулентный штамм N 3 сальмонелла тифимуриум с целью выявления оптимальной дозы СРМ для наибольшего накопления общей биомассы указанного микроорганизма. С этой целью к основной питательной среде для данного микроба добавляли СРМ в концентрации 1, 2, 3, 4, 5%. Питательную среду разливали в пробирки в объеме по 5 мл и после стерилизации в нее засевали по 0,1 мл суточной бульонной культуры сальмонелла тифимуриум. Культивирование проводили при температуре 37^oC в течение суток. После этого культуру сальмонелл центрифугировали и определяли общую биомассу выросших микробов путем взвешивания осадка на торзионных весах. Контролем служили пробирки с выросшими культурами сальмонелл в питательных средах без стимулятора.

Установлено, что наибольшее накопление биомассы сальмонелл было в средах с 2 и 3% СРМ. В таких средах накопление сальмонелл по результатам трех опытов было на 30 - 32% выше, чем в средах с 1, 4 и 5% стимулятора.

Пример 7. В лабораторных опытах культивировали авирулентный штамм ВР-2 возбудителя рожи с целью выявления оптимальной дозы СРМ для наибольшего накопления общей биомассы и количества живых микробных клеток указанного микроорганизма. С этой целью к основной питательной среде для данного микроба добавляли СРМ в концентрации 1, 2, 3, 4, 5, 6%. Питательную среду разливали в пробирки по 5 мл и после стерилизации среды в нее добавляли по 0,1 мл суточной бульонной культуры возбудителя рожи. Культивирование осуществляли при температуре 37^oC в течение суток. После этого культуру возбудителя рожи центрифугировали, подвергали ее лиофильной сушке и в полученном материале определяли количество живых микробных клеток. Контролем служили пробирки с выросшими культурами возбудителя рожи в питательной среде без стимулятора.

Установлено, что после лиофильной сушки количество живых микробных клеток в среде со СРМ в концентрациях 4 - 5% было в два раза больше по сравнению со средами без стимулятора.

Пример 8. В лабораторных опытах проводили культивирование полевых штаммов возбудителя актинобациллеза с целью выявления оптимальной дозы СРМ для наибольшего накопления биологической массы. С этой целью к основной питательной среде для этого микроба добавляли СРМ в концентрации 1, 2, 3, 4, 5%. Питательную среду разливали в пробирки по 5 мл и после стерилизации среды в нее засеивали по 0,1 мл суточной культуры актинобацилл. Культивирование актинобацилл проводили при температуре 37^oC в течение суток. После культивирования культуру актинобацилл центрифугировали и определяли общую биологическую массу выросших микробов путем взвешивания осадка на торзионных весах. Контролем служили пробирки с выросшими культурами актинобацилл в питательных средах без стимулятора.

Установлено, что наибольшее накопление биомассы актинобацилл было в средах с тремя и четырьмя процентами СРМ. В таких средах накопление актинобацилл по результатам было на 30 - 40 - 100% выше, чем в средах с 1, 2 и 5% стимулятора.

По сравнению с прототипом и известными техническими решениями предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества:
правильный подбор необходимых компонентов, установленных на основании опытов, основы питательной среды, температурного режима для культивирования гриба на основе экстракта чая и организованный контроль за его развитием позволили установить стабильность и качество микрофлоры в ассоциации микроорганизмов, что является важным для получения стандартной культуральной жидкости;
на основании исследований ростстимулирующей способности СРМ установлено, что по отношению к микроорганизмам он является универсальным. Так по отношению к возбудителю рожи он проявил ростстимулирующий эффект в питательных средах в концентрации 4 - 5%, обеспечивая накопление живых микроорганизмов в два раза больше, чем при культивировании данного микроба в среде без стимулятора, возбудителей листериоза, сальмонеллезов, актинобациллеза, СРМ проявил ростстимулирующий эффект при добавлении его в среды в концентрации соответственно 1,5 - 2,0, 2 - 3 и 3 - 4%, обеспечивая накопление общей биомассы и количество живых микробных клеток на 30 - 100% больше, чем в средах без стимулятора.

Таким образом, СРМ является универсальным, обеспечивающим высокое накопление общей биомассы микроорганизмов и количества живых микробных клеток, а также обеспечивает большой выход живых микробов после воздействия на них различных факторов при лиофильной сушке и обеспечивает предприятиям биологической промышленности значительное повышение производительности труда при небольших затратах на приготовление СРМ;
применение СРМ в условиях промышленного изготовления вакцины, например, только против листериоза обеспечивает ежегодный экономический эффект.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения и применения стимуляторов роста микроорганизмов , и может быть использовано для приготовления препаратов в диагностических, профилактических и лечебных целях. Способ заключается в том, что культивирование гриба производят в водном экстракте чая с содержанием 10% пищевого сахара с последующим отделением целевого продукта. При этом в воде при температуре кипения экстрагируют в течение 30 мин 1% чая с добавлением пищевого са- хара. Затем воду охлаждают до 28 - 30^oC, засевают 10%-ной культуральной жидкостью микробной ассоциации гриба. Культивирование осуществляют в течение 3 - 4 недель при вышеуказанной температуре. Способ использования стимулятора роста микроорганизмов предусматривает введение его в питательную среду для соответствующего микроорганизма. При этом для роста и размножения возбудителей листериоза стимулятор вводят в дозе 1,5 - 2%, сальмонеллеза - 2 - 3%, возбудителей рожи - 4 - 5 %, актинобациллеза - 3 - 4%. Способ является универсальным. Он обеспечивает высокое накопление общей биомассы микроорганизмов и количества живых микробных клеток, а также обеспечивает большой выход живых микробов после воздействия на них различных факторов при лиофильной сушке. 2 с.п. ф-лы.

1. Способ получения стимулятора роста микроорганизмов, предусматривающий культивирование гриба в водном экстракте чая с содержанием 5 - 10% пищевого сахара и отделение целевого продукта, отличающийся тем, что в воде при температуре кипения экстрагируют в течение 30 мин 1% чая с добавлением пищевого сахара, затем воду охлаждают до 28 - 30^oC, засевают 10%-ной культуральной жидкостью микробной ассоциации гриба, при этом культивирование осуществляют в течение 3 - 4 недель при указанной температуре. 2. Способ применения стимулятора роста микроорганизмов, предусматривающий введение его в питательную среду для соответствующего микроорганизма, отличающийся тем, что для роста и размножения возбудителей листериоза, стимулятор роста микроорганизмов вводят в дозе 1,5 - 2%, сальмонеллеза 2 - 3%, возбудителей рожи 4 - 5%, актинобациллеза 3 - 4%.