ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и может быть использовано на этапе накопления биомассы штамма продуцента при производстве живой туляремийной вакцины.

Известно, что возбудитель туляремии требователен к составу питательных сред. Для его выращивания обычно используют белковые среды на основе естественных субстратов: яичного желтка, крови, печени, мозга и пр. [Олсуфьев И.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. - М.: Медицина, 1975. - 190 с.]. При этом часто для стимулирования роста используются витаминно-минеральные добавки, содержащие, в частности, пантотенат кальция, тиамин, цистеин или цистин, ионы магния [Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие. / Под ред. А.С.Лабинской, Л.П.Блинковой, А.С.Ещиной.- М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 600 с.].

Для культивирования туляремийных бактерий нашли широкое применение плотные (агаровые) среды, содержащие в качестве основы гидролизаты (автолизаты) рыбы или мяса, экстракты или автолизаты дрожжей с обязательным добавлением цистеина (цистина) 0,1% и глюкозы 1%. Однако плотные питательные среды не пригодны для глубинного культивирования и накопления биомассы туляремийного микроба в условиях производства медицинских иммунобиологических препаратов.

В производстве живой туляремийной вакцины до настоящего времени для накопления биомассы в условиях глубинного культивирования использовали полужидкие среды. В состав сред входят гидролизаты свежей рыбы, печени или мяса - 20-30%, гидролизат желатины - 10%, желатин - 1,5%, хлористый натрий - 0,5%, глюкоза - 1%, цистин - 0,1%; pH среды 7,2-7,3 [Колядицкая Л.С., Шмурыгина А.А. Усовершенствование препарата сухой живой туляремийной вакцины. // ЖМЭИ. - 1957, №10. - С.84-89]. Посевная доза составляет 0,5-1,0 млрд.м.к./мл питательной среды (по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО-42-28-85-П (10 ME) ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, эквивалентной концентрации 5 млрд.м.к./мл). Эффективность полужидких сред, применяемых для производства вакцины, невелика, после 18-20 ч выращивания густота взвеси увеличивается в 5-6 раз [Олсуфьев Н.Г. Туляремия. - 1960. - 167 с.].

Жидкие среды на белковой основе, для культивирования туляремийного микроба, испытывали в разных вариантах, но, как правило, рост удавался лишь при массивной посевной дозе [Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. - М.: Медицина, 1975. - 190 с.]. В качестве жидкой среды Чемберлена используется сывороточно-глюкозо-цистиновый бульон [Francis Е. The amino-acid cistine in the cultivation of tularence // Public Health Reports. - 1923, Vol.38 (3). - P.324-7.]. Размножение туляремийного микроба в этой среде наблюдается лишь при засеве 1-2 млрд. микробных клеток на 1 мл среды (по стандарту мутности).

Известна многокомпонентная, синтетическая жидкая питательная среда, содержащая, в г/л: L-аргинин - 0,2, L-цистеин - 1,5, L-гистидин - 2,0, L-изолейцин - 0,3, DL-метионин - 1,0, DL-дейцин - 0,4, L-лизин - 0,4, L-пролин - 1,0, DL-треонин - 4,0, L-тирозин - 0,2, L-валин - 0,8, глюкозу - 15,0, тиамин - 0,02, пантотенат кальция - 0,05, MgSO4 - 0,04, NaCl - 5,0, Na2HPO4 - 1,774, KH2PO4 - 2,837 [Майский В.Г., Шишов И.Н., Басилова Г.И. Питательные потребности Francisella tularensis II Микробиол. - 1984. - 6. - С.20-23]. Недостатком данной среды является высокая себестоимость.

Известна жидкая полусинтетическая питательная среда (pH 7,2), содержащая в качестве основы дрожжевой экстракт 5 г/л с добавлением солей (фосфат однозамещенный 12 г/л, натрий хлористый 10 г/л, калий гидроксид - 3,9 г/л, сульфат железа (II) семиводный 6 г/л), глюкозы 2 г/л и цистеина 0,1 г/л, которую предлагается использовать для молекулярно-генетических исследований туляремийного микроба [Лапин А.А., Павлов В.М., Домотенко Л.В., Храмов М.В., Мокриевич А.Н. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis II Проблемы особо опасных инфекций. - 2009, №102. - С.66-67].

Известна полусинтетическая питательная среда T, содержащая в качестве питательной основы сердечно-мозговой настой 10 г/л, бактотриптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 10 г/л, казаминовые кислоты 10 г/л; в качестве глюкозо-солевой добавки используют раствор, содержащий MgSO4, FeSO4, KCl, K2HPO4, глюкозу, цистеин, цитрат натрия, который добавляют в питательную среду перед использованием [Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. Прозрачная питательная среда для культивирования Francisella tularensis II Антибиотики и мед. биотехнол. - 1987, вып.32. - С.133-137].

Недостатком приведенных выше жидких питательных сред является относительно высокая их себестоимость и недостаточная эффективность, в частности они не обеспечивают необходимого прироста жизнеспособных микроорганизмов в логарифмическую фазу за 20-24 ч.

В патенте RU 2451743 [БИПМ №15 27.05.2012 г.] для получения биомассы туляремийного микроба методом глубинного культивирования предложена жидкая питательная среда, содержащая, г/л: панкреатический гидролизат рыбокостной муки 20,5, стимулятор роста гемофильных организмов 5, экстракт пекарских дрожжей 2,3, сульфат магния 1,0, сульфит натрия 0,7, дигидрофосфат калия 1, цистеин 0,5. При культивировании туляремийного микроба в среду добавляют раствор глюкозо-витаминной добавки (1,23 г/л) в количестве 2 мл на 100 мл среды. Накопление биомассы на этой среде через 18±2 ч. составляет 18 млрд.м.к./мл. Недостатком данной среды является многокомпонентность и недостаточная ее эффективность по способности накапливать биомассу микроорганизма с целью производства живой туляремийной вакцины.

Задачей настоящего изобретения является конструирование качественной простой питательной среды, которая обеспечивает повышение выхода биомассы туляремийного микроба.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности питательной среды для накопления биомассы, пригодной для производства МИБП (в т.ч. живой туляремийной вакцины), расширении сырьевой базы для приготовления белковой основы питательной среды, удешевлении ее за счет использования отхода сывороточно-вакцинного производства, а также обеспечении рациональной утилизации отходов, образующихся при производстве лечебных препаратов.

Технический результат достигается тем, что питательная среда содержит сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства, глюкозу, пантотенат кальция, при следующем соотношении компонентов, г/л:

ферментативный гидролизат фибрина 50-55 (до содержания не менее 0,32% аминного азота)   глюкоза 10 пантотенат кальция 0,05 вода дистиллированная остальное pH 7,0-7,2

Сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства, используют в качестве питательной основы заявляемой питательной среды. Ферментативный гидролизат фибрина - панкреатический перевар фибриллярного белка крови является ценной белковой основой питательных сред.

Приготовление жидкого ферментативного гидролизата фибрина приведено в патенте RU 2425866 [БИПМ №22 10.08.2011 г.]. В последнее время жидкие белковые гидролизаты, используемые в качестве основ для питательных сред, готовят в сухой форме. Сухой гидролизат удобно транспортировать и хранить длительное время при комнатной температуре при сохранении его качества, в отличие от жидкой формы, хранящейся при (6±2)°C. Жидкую форму ферментативного гидролизата фибрина концентрировали в 6-7 раз методом выпаривания на установке вакуум-выпарной УВВ-50 и высушивали конвекционным способом на сушильной установке распылительного типа КЯУЛ 101325.002 в «псевдокипящем слое».

По агрегатному состоянию высушенный ферментативный гидролизат фибрина представлял собой мелкодисперсный порошок с нежно-желтым оттенком. При анализе физико-химических показателей определено: содержание общего азота - (0,76±0,03)%; аминного азота - (0,39±0,03)%; процент расщепления белка - (50,7±1,7)%; содержание пептона (по шкале Дифко) - (53,7±1,5)%; следы непереваренного белка отсутствовали; сухой остаток - (4,7±0,2)%; хлориды - (0,22±0,01)%; влажность - (2,4±0,2)%; pH - (6,9±0,2), что соответствует требованиям, предъявляемым к сухим основам питательных сред. Контроль сухой формы основы питательной среды осуществляли согласно нормативным документам [Методы контроля бактериологических питательных сред: Методические указания МУК 4.2.2316-08. - М.: Роспотребнадзор. - 2008. - 67 с.; Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96. - М.: Информационно-издательский центр Минздрава России. - 1998. - 128 с.].

Питательную среду с основой из ферментативного гидролизата фибрина для выращивания туляремийного микроба готовят следующим способом. Бульон варят в реакторе: под вакуумом закачивают воду, очищенную методом дистилляции, прибавляя 10% на ее выкипание, добавляют 50-55 г/л сухого ферментативного гидролизата фибрина в количестве, обеспечивающем содержание в среде не менее 0,32% аминного азота. Затем вносят глюкозу до концентрации 1%. Все перемешивают и устанавливают в среде рН (7,2+0,2) при помощи 20% раствора натрия гидроокиси и кипятят в течение 30 мин. Бульон фильтруют через фильтр Сальникова при температуре (75±5)°C под давлением (2,5±0,5) МПа. Жидкую среду из ферментативного гидролизата фибрина стерилизуют водяным насыщенным паром при (110+2)°C в течение 30 мин, давление (0,05±0,02) МПа. Перед внесением инокулята посевной культуры в стерильную среду добавляют стерильный раствор пантотената кальция в концентрации 0,005% (0,05 г/л).

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.

Пример 1. Глубинное культивирование туляремийного микроба в жидкой питательной среде.

Для определения эффективности заявляемой среды использовали штамм-продуцент живой туляремийной вакцины Francisella tularensis 15 НИИЭГ. Посевная доза культуры F. tularensis 15 НИИЭГ, выращенной на коммерческой плотной питательной среде FT-arape должна быть не менее 1 млрд.м.к./мл (по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО-42-28-85-П (10 ME) ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, эквивалентной концентрации 5 млрд.м.к./мл).

Подготовленную культуру F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ выращивают методом глубинного культивирования в биореакторе с автоматическим поддержанием параметров культивирования: аэрация 0,5-0,7 л воздуха на 1 л питательной среды, скорость перемешивания 500 об/мин в течение 20±2 ч на жидкой питательной среде следующего состава: гидролизат фибрина 5%, глюкоза 1%, пантотенат кальция 0,005% pH 7,2 при температуре 37°C. После окончания процесса культивирования нативная культура F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ имеет следующие характеристики: pH 7,0±0,1, концентрация микробных клеток 35±0,5 млрд.м.к. в мл среды (по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО мутности 42-28-85-П (10 ME) ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, эквивалентной концентрации 5 млрд.м.кл./мл).

Биомасса туляремийного микроба, полученная на заявляемой питательной среде, на основе гидролизата фибирина, обладает морфологическими (форма и размер клеток) и культуральными (форма колонии) свойствами, характерными для возбудителя туляремии. Полученная биомасса туляремийного микроба обладает следующими характеристиками: коэффициент жизнеспособности 62±0,5%, степень диссоциации 97±1% SR (белых) иммуногенных колоний от общего количества выросших. Культурально-морфологические признаки, типичные для туляремийного микроба: мелкие кокковидные палочки, неподвижные, грамотрицательные. Культура агглютинируется туляремийной сывороткой до титра 1:3200.

Таким образом, заявляемая питательная среда для глубинного культивирования туляремийного микроба на основе ферментативного гидролизата фибрина позволяет накапливать и получать в течение 20±2 ч высокую концентрацию (до 35±0,5 млрд.м.к. в мл среды) жизнеспособной биомассы F. tularensis с низкой степенью диссоциации, в количестве, превышающем результат на аналогичных средах, что позволяет существенно сократить себестоимость питательной среды и соответственно конечного препарата МИБП. Показатель эффективности сред, полученных на основе гидролизата фибрина, в 2 раза выше по сравнению со средой, полученной на основе панкреотического гидролизата рыбокостной муки. Увеличение выхода биомассы микроорганизмов обусловлено наличием в питательной среде сбалансированного и полноценного состава.

Изобретение расширяет спектр питательных сред для накопления бактериальной массы F. tularensis и впервые позволяет проводить накопление его биомассы в жидкой среде в условиях глубинного культивирования. Использование в составе жидкой среды гидролизата фибрина, являющегося отходом сывороточно-вакцинного производства, позволяет утилизировать отходы и снижает загрязнение внешней среды, а также повышает рентабельность производства вакцины за счет использования экономически выгодной питательной среды, а масштабы сывороточно-вакцинного производства позволяют получать значительное количество такого сырья.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и может быть использовано на этапе накопления биомассы штамма продуцента при производстве живой туляремийной вакцины. Питательная среда для глубинного культивирования туляремийного микроба содержит в качестве основы, обеспечивающей содержание аминного азота в среде не менее 0,32%, сухой ферментативный гидролизат фибрина, получаемый из отхода сывороточно-вакцинного производства, и в заданном соотношении компоненты - глюкозу и пантотенат кальция. Изобретение позволяет получить экономически выгодную и эффективную по продуктивности питательную среду для накопления бактериальной массы Francisella tularensis, что расширяет спектр питательных сред и впервые позволяет проводить накопление его биомассы в жидкой среде в условиях глубинного культивирования. 1 пр.

Питательная среда для накопления биомассы туляремийного микроба, содержащая питательную основу, глюкозу, отличающаяся тем, в качестве питательной основы содержит сухой ферментативный гидролизат фибрина - отхода сывороточно-вакцинного производства, и дополнительно содержит пантотенат кальция, при следующем соотношении компонентов, г/л:
ферментативный гидролизат фибрина 50-55 (до содержания не менее 0,32% аминного азота)   глюкоза 10 пантотенат кальция 0,05 вода дистиллированная остальное pH 7,0-7,2