СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА РОСТА LISTERIA MONOCYTOGENES ИЗ АКТИВИРОВАННОЙ ЭМБРИОНАЛЬНО-ЯИЧНОЙ МАССЫ ПЕРЕПЕЛОК Российский патент 2014 года по МПК C12N1/38 C12N1/20 

Описание патента на изобретение RU2535980C2

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов, и может быть использовано при их культивировании, в частности при культивировании штамма АУФ Listeria monocytogenes.

Уровень техники

Известен способ получения стимулятора роста микроорганизмов из чайного гриба, в том числе используемый при культивирования листерий. Способ заключается в том, что культивирование гриба производят в водном экстракте чая с содержанием 10% пищевого сахара с последующим отделением целевого продукта. При этом в воде при температуре кипения экстрагируют в течение 30 мин 1% чая с добавлением пищевого сахара. Затем воду охлаждают до 28-30°C, засевают 10%-ной культуральной жидкостью микробной ассоциации гриба. Культивирование осуществляют в течение 3-4 недель при вышеуказанной температуре. Способ использования стимулятора роста микроорганизмов предусматривает введение его в питательную среду для соответствующего микроорганизма. При этом для роста и размножения возбудителей листериоза стимулятор вводят в дозе 1,5-2% (см. пат. РФ №2115720, кл. C12N 1/14, опубл. 20.07.1998 г.).

Недостатком данного стимулятора роста микроорганизмов является сложность технологического процесса и доступности объекта.

Для стимулирования роста листерий известен способ получения автолизата печени крупного рогатого скота. Его изготавливают из свежемороженой печени крупного рогатого скота путем ее измельчения в мясорубке. На 1 кг фарша добавляют 4 л деионизированной воды и 1,5% химически чистой соляной кислоты. Смесь компонентов перемешивают, добавляют к ней 1-1,5% раствор хлороформа, разливают в баллоны и помещают в термостат при температуре 39-40°C на 7 суток. Смесь перемешивают 3-4 раза в сутки. На 7 сутки готовый гидролизат декантируют, подвергают фильтрации через ватно-марлевый фильтр, разливают в баллоны и добавляют 1% хлороформа (см. техн. регл. 00482861-0061-2009).

Недостатком данного способа получения стимулятора роста является высокая себестоимость конечного продукта.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ приготовления эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов, в том числе для Listeria monocytogenes, включающий инкубацию куриного яйца в течение 9 суток, причем на 5, 6, 7 сутки куриное яйцо облучают в течение 30 секунд при частоте модуляции 9 Гц и мощности излучения 9 мВт и охлаждают в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию куриного яйца, охлажденного при температуре 2-4°C, центрифугирование при 15000 об/мин, затем полученную массу фильтруют и подвергают тиндализации при температуре 60-65°C в течение 5-6 суток, фасуют и лиофилизируют (патент РФ №2283347, C12N 1/38, A23K 3/00, опубл. 10.09.2006).

Недостатком данного эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов является не до конца раскрытый потенциал сырья.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения стимулятора роста микроорганизмов из активированной эмбрионально-яичной массы перепелок, обладающего высоким качеством и повышающего выход бактериальной массы при культивировании Listeria monocytogenes.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к повышению объема бактериальной массы при культивировании Listeria monocytogenes, повышению качества стимулятора.

Технический результат достигается с помощью способа получения стимулятора роста Listeria monocytogenes, включающего инкубацию яйца птицы с последующим охлаждением в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию, фильтрацию, центрифугирование, фильтрацию, тиндализацию в течение 5-6 суток, фасовку, при этом согласно изобретению в качестве яиц птицы используют перепелиные яйца, инкубируют их в течение 8 суток, перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки инкубации осуществляют озонирование яиц в течение 15 минут (2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси), после фильтрации полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3 и затем проводят тиндализацию при температуре 55-59°C.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа получения стимулятора роста микроорганизмов из активированной эмбрионально-яичной массы перепелок.

Пример №1. Проводят отбор свежих перепелиных яиц, полученных из благополучного хозяйства, со средней массой 11-14 г, затем их инкубируют в течение 8-9 суток, причем перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки яйца озонируют в течение 15 минут (2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси) в полиэтиленовом мешке объемом 35 л, затем яйца охлаждают в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, затем проводят гомогенизацию яиц, гомогенат фильтруют через марлевый фильтр и полученный фильтрат разбавляют дистиллированной водой в соотношение 1:1 (одна часть дистиллированной воды к одной части фильтрата). Затем полученную массу подвергают тиндализации при температуре 55-59°C в течение 5-6 суток и фасуют во флаконы по 250 мл.

Полученный стимулятор обладает недостатками: препарат при применении не дает эффекта повышения объема бактериальной массы и при добавлении вызывает сильное помутнение среды, при тиндализации происходит свертывание препарата.

Пример №2. Проводят аналогично примеру №1, но после фильтрации проводят центрифугирование при 8000 об/мин, затем полученную массу вновь фильтруют, разбавляют дистиллированной водой, тиндализуют и фасуют.

Полученный стимулятор не дает эффекта повышения бактериальной массы и сворачивается при тиндализации.

Пример №3. Проводят аналогично примеру №2, но полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3. Стимулятор при данных параметрах обладает высоким эффектом повышения активности прироста бактериальной массы и не сворачивается при тиндализации.

Пример №4. Проводят аналогично примеру №3, но препарат подвергают тиндализации при температуре 70°C в течение 3 суток.

Полученный стимулятор содержит слишком много балластных частиц и при добавлении вызывает помутнение питательной среды.

Таким образом, наиболее оптимальным и соответствующим требованиям роста и размножения Listeria monocytogenes является способ получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов по примеру №3.

Для подтверждения качества стимулятора роста, полученного предлагаемым способом, было проведено исследование его химического состава, испытание на активность способом К. Бакирджиева (Калашник, И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии / И.А. Калашник. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Урожай. - 1990. - 160 с), а также его испытание при культивировании штамма АУФ Listeria monocytogenes.

Было проведено химическое исследование полученного стимулятора роста на наличие аминокислот, микро- и макроэлементов. На основании проведенных исследований получены результаты, представленные в таблице 1.

Таблица 1 Некоторые химические компоненты стимулятора роста микроорганизмов из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов, приготовленного по примеру №3 Химические компоненты/качественные показатели Количественные показатели 1. Аминокислоты:* треонин количество не рассчитывали цистин количество не рассчитывали изолейцин количество не рассчитывали аспарагин количество не рассчитывали аспарагиновая кислота количество не рассчитывали валин количество не рассчитывали лизин количество не рассчитывали аргинин количество не рассчитывали метионин количество не рассчитывали 2. Микро- и макроэлементы** мкг/мл: цинк 0,20±0,09 железо 1,60±0,11 натрий 353,0±4,2 калии 516,0±5,4 магний 16,0±0,5 кальций 20,50±0,30 марганец отсутствует медь отсутствует *Анализ свободных аминокислот осуществляли методом тонкослойной хроматографии (Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ц., 1980). **Анализ микро- и макроэлементов проводили методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе ААС марки Perkin Elmer 2280 (производство США) (Ягодин Б.А., Дерюгин И.П., Жуков Ю.П., и др., 1987).

При исследовании биологической активности способом К. Бакирджиева активность пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae при добавлении к среде выращивания препарата, приготовленного по примеру №3, увеличилась на 62% по сравнению с контролем.

Таким образом, разработанный способ получения стимулятора роста Listeria monocytogenes из активированной эмбрионально-яичной массы перепелок позволяет получить продукт с высокой биологической активностью, а также сохранить в нем широкий набор биологических компонентов, что указывает на его высокое качество.

Культивирование штамма АУФ Listeria monocytogenes производилось на бульоне Хоттингера с добавлением препарата, приготовленного по примеру №3 (в концентрации 1%). Через сутки был произведен посев культуры на агар Хоттингера для определения количества живых микробных клеток в суточной культуре бульона Хоттингера путем подсчета колоний. При подсчете колоний на агаре их количество увеличилось по сравнению с контролем в 1,5 раза (таблица 2), что говорит о повышении роста и размножения Listeria monocytogenes, а следовательно, и повышении выхода бактериальной массы при использовании способа согласно изобретению.

Таблица 2 Культуральные свойства Listeria monocytogenes № примера Количество колоний Listeria monocytogenes (M±m) №1 Опыт 50,3±0,88 №2 Контроль 33,3±0,86 Результаты, приведенные в таблице, статистически достоверны(P<0,05)
№1 Количество живых микробных клеток в суточной культуре бульона Хоттингера с добавлением предлагаемого стимулятора роста.
№2 Количество живых микробных клеток в суточной культуре бульона Хоттингера без добавления предлагаемого стимулятора роста.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- стимулятор, полученный с помощью предлагаемого изобретения, обладает значительной эффективностью повышения роста и размножения Listeria monocytogenes, повышает выход бактериальной массы;

- имеет богатый химический состав, включает большое количество высокоактивных низкомолекулярных азотистых соединений, содержит разнообразные макро- и микроэлементы;

- имеет высокую биологическую активность.

Похожие патенты RU2535980C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОГО СТИМУЛЯТОРА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ 2004
  • Тимченко Людмила Дмитриевна
  • Ржепаковский Игорь Владимирович
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Афанасьев Евгений Николаевич
  • Вакулин Валерий Николаевич
  • Косик Наталья Викторовна
RU2283347C2
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛИСТЕРИОЗА 2012
  • Катунина Людмила Семёновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Жданова Елена Владимировна
  • Тимченко Людмила Дмитриевна
  • Ржепаковский Игорь Владимирович
  • Сизоненко Марина Николаевна
  • Романенко Ольга Александровна
  • Жаринова Нина Вадимовна
  • Коготкова Ольга Ивановна
RU2525637C2
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ПОСТЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ 2021
  • Коптев Вячеслав Юрьевич
  • Захарова Варвара Сергеевна
  • Демченко Дарья Андреевна
  • Кобзев Александр Дмитриевич
  • Тихонова Наталия Борисовна
  • Милованов Андрей Петрович
  • Темнов Андрей Александрович
RU2787185C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ 2009
  • Катунина Людмила Семёновна
  • Тимченко Людмила Дмитриевна
  • Темежникова Надежда Дмитриевна
  • Вакулин Валерий Николаевич
  • Таран Татьяна Викторовна
  • Таран Александр Владимирович
  • Савельева Ирина Вилориевна
  • Зуенко Анастасия Анатольевна
  • Ковтун Юрий Сергеевич
  • Ашихмина Марина Александровна
RU2412240C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА 2016
  • Катунина Людмила Семеновна
  • Куличенко Александр Николаевич
  • Курилова Анна Алексеевна
  • Зуенко Анастасия Анатольевна
  • Тимченко Людмила Дмитриевна
  • Ржепаковский Игорь Владимирович
  • Бондарева Надежда Ивановна
  • Аванесян Светлана Суреновна
  • Вакулин Валерий Николаевич
  • Сизоненко Марина Николаевна
RU2648153C1
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПЛЕКСНОЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ НА ОСНОВЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ 2006
  • Тимченко Людмила Дмитриевна
  • Ржепаковский Игорь Владимирович
  • Вакулин Валерий Николаевич
  • Каузова Алла Станиславовна
  • Калинская Наталия Сергеевна
RU2320197C1
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ И ПРОБИОТИКОВ 2005
  • Тимченко Людмила Дмитриевна
  • Ржепаковский Игорь Владимирович
  • Вакулин Валерий Николаевич
  • Гандрабурова Надежда Ивановна
RU2303368C1
СТИМУЛЯТОР РОСТА Yersinia pseudotuberculosis 2012
  • Кривошеева Ангелина Михайловна
  • Бузолева Любовь Степановна
  • Айздайчер Нина Александровна
RU2502796C2
СПОСОБ ДЕЗИНФЕКЦИИ ИНКУБАЦИОННЫХ ЯИЦ ПЕРЕПЕЛОВ 2020
  • Лыско Светлана Борисовна
  • Задорожная Марина Валерьевна
  • Сунцова Ольга Александровна
  • Ковалёв Владимир Николаевич
RU2736327C1
Способ хранения инкубационных яиц уток 2017
  • Дядичкина Людмила Федоровна
  • Позднякова Нина Сергеевна
  • Мелехина Татьяна Александровна
  • Голдин Юрий Сергеевич
  • Юхачева Нина Алексеевна
  • Минахина Валентина Анатольевна
RU2658845C1

Реферат патента 2014 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА РОСТА LISTERIA MONOCYTOGENES ИЗ АКТИВИРОВАННОЙ ЭМБРИОНАЛЬНО-ЯИЧНОЙ МАССЫ ПЕРЕПЕЛОК

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения стимулятора роста Listeria monocytogenes предусматривает инкубацию яйца птицы с последующим охлаждением в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию, фильтрацию, центрифугирование, фильтрацию, тиндализацию в течение 5-6 суток, фасовку. При этом в качестве яиц птицы используют перепелиные яйца, инкубируют их в течение 8 суток, перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки инкубации осуществляют озонирование яиц в течение 15 минут 2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси. После фильтрации полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3 и затем проводят тиндализацию при температуре 55-59°C. Способ позволяет увеличить объем бактериальной массы и повысить качество стимулятора. 2 табл., 4 пр.

Формула изобретения RU 2 535 980 C2

Способ получения стимулятора роста Listeria monocytogenes, включающий инкубацию яйца птицы с последующим охлаждением в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию, фильтрацию, центрифугирование, фильтрацию, тиндализацию в течение 5-6 суток, фасовку, отличающийся тем, что в качестве яиц птицы используют перепелиные яйца, инкубируют их в течение 8 суток, перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки инкубации осуществляют озонирование яиц в течение 15 минут 2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси, после фильтрации полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3 и затем проводят тиндализацию при температуре 55-59°C.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2014 года RU2535980C2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОГО СТИМУЛЯТОРА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ 2004
  • Тимченко Людмила Дмитриевна
  • Ржепаковский Игорь Владимирович
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Афанасьев Евгений Николаевич
  • Вакулин Валерий Николаевич
  • Косик Наталья Викторовна
RU2283347C2
СПОСОБ И.К.ТУТОВА И В.И.СИТЬКОВА ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ 1996
  • Тутов Иван Кириллович
  • Ситьков Виктор Иванович
RU2115720C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ 1998
  • Омарова С.М.
  • Ахмедова Э.М.
  • Тагирова Г.М.
  • Меджидов Ш.М.
RU2158758C2

RU 2 535 980 C2

Авторы

Тимченко Людмила Дмитриевна

Сизоненко Марина Николаевна

Ржепаковский Игорь Владимирович

Ткаченко Инна Николаевна

Вакулин Валерий Николаевич

Даты

2014-12-20Публикация

2013-03-22Подача