ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ КАРМИНОМИЦИН-4-О-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК C12N15/54 C12P19/56 C12N9/10 

Описание патента на изобретение RU2115731C1

Настоящее изобретение относится к области продуцирования антрациклинов, используемых при лечении рака, путем модификации биосинтеза даунорубицина в целях усиления продуцирования даунорубицина из карминомицина в стрептомицетах, не являющихся Streptomyces peucetius 29050, а также в экстрактах бактериальных клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам получения и использования ферментов, участвующих в биосинтезе антрациклинов.

Антрациклины группы даунорубицинов, такие как доксорубицин, карминомицин и аклациномицин, являются наиболее широко используемыми лекарственными средствами, применяемыми в противораковой терапии [F. Arcamone, Doxorubicin, Academic Press, New York, 1981, pp. 12 - 25; A.Grein, Process Biochem. 16, 34, 1981; T.Kaneko, Chimicaoggi May, 11, 1988].

В целях усиления противоопухолевой активности, особенно при пероральном способе введения, а также в целях устранения острой токсичности и хронической кардиотоксичности, связанной с использованием этих лекарственных средств при лечении рака [Penco, Process Biochem. 15, 12, 1980; T. Kaneko, Chimicaoggi May, 11, 1988], путем химического синтеза были получены усовершенствованные производные даунорубицина и доксорубицина.

Примерами таких аналогов являются 4'-эпидоксорубицин (Epirubicin®) и 4-деметоксидаунорубицин (I-darubicin®).
Природные формы даунорубицинов продуцируются различными штаммами стрептомицетов (S. peucetius, S.coeruleorubidus, S. galilaeus, S.griseus, S.griseoruber, S. insignis, S. viridochromogenes, S.bifurcus и Streptomyces sp. штамм с 5), а также Actinomyces carminata. Доксорубицин продуцируется только S. peucetius, подвидом caesius, а даунорубицин продуцируется как S.peucetius, так и другими штаммами стрептомицетов, указанными выше. Штаммы S.peucetius подвид caesius IMRU 3920 (этот штамм идентичен АТСС 27952, и далее он будет сокращенно обозначаться "S.peucetius 3920"), S.peucetius АТСС 29050 ("S. peucetius 29050") и S.peucetius подвид caesius АТСС 27952 ("S.peucetius 27952") известны и описаны в патенте US N 3590028. S.peucetius 29050 и 27952 были депонированы в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, МД, США, под номерами АТСС 29050 и 27952.

Антрациклин доксорубицин (2) синтезируется S.peucetius 27952 из малоновой кислоты, пропионовой кислоты и глюкозы в соответствии с путем метаболизма, показанным на фиг.1 (см. фигуры, предлагаемые в конце описания). Как видно из фиг.1, ε-родомицинон (4), карминомицин (3) и даунорубицин (1) являются промежуточными соединениями в данном метаболическом процессе [Grein, Advan.Appl. Microbiol.32, 203, 1987, Eckardt and Wagner, J. Basic Microbiol. 28, 137, 1988]. Две стадии указанного пути метаболизма включают в себя О-метилирование дискретных промежуточных соединений, а именно превращение алкановой кислоты в метилакланонат и превращение карминомицина (3) в даунорубицин (1). Было показано, что бесклеточные экстракты S.peucetius 29050, S. insignis АТСС 31913, S. coeruleorubidus АТСС 31276 и Streptomyces sp. C5 катализуют последнюю из двух вышеуказанных стадий в присутствии S-аденозил-L-метионина [Connors et al., J. Gen. Microbiol. 136, 1985 (1990), что позволяет предположить, что все указанные штаммы содержат специфическую карминомицин-4-O-метилтрансферазу (COMT-белок).

Гены, кодирующие биосинтез даунорубицина и резистентность к даунорубицину, были получены из S.peucetius 29050 и S.peucetius 27952 путем экспериментального клонирования [Stutzman-Engwall and Hutchinson, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 86, 3135, 1988; Otten et al., J. Bacteriol. 172, 3427, 1990]. Эти исследования показали, что при введении в Streptomyces lividans 1326 указанные клонированные гены придают хозяевам способность к продуцированию ε-родомицинона и резистентность к даунорубицину и доксорубицину. В последней работе были проведены исследования, целью которых была проверка, могут ли указанные клоны приобретать способность к превращению карминомицина в даунорубицин при введении их в S.lividans. Для этого был выделен ДНК-сегмент размером 1,6 тыс. пар оснований (кв), который включает ген карминомицин-4-O-метилтрансферазы, сокращено обозначаемый далее "dnr K".

Предметом настоящего изобретения является способ продуцирования высоких уровней карминомицин-4-O-метилтрансферазы на базе технологии рекомбинантных ДНК, а также получаемая этим способом рекомбинантная форма фермента.

На фиг.1 схематически проиллюстрирован путь биосинтеза доксорубицина.

На фиг.2 представлена регистрационная карта первой ДНК настоящего изобретения, которая представляет собой вставку в рекомбинантной плазмиде pWHM 902, сконструированной путем инсерции Sphl/Pvull-(1,6 кв) фрагмента, ДНК, содержащего ген карминомицин-4-O-трансферазы (dnrK) в Sphl/Smal сайты плазмиды pWHM3, представляющей собой E.coli-Streptomyces - челночный вектор [Vara et al. , J.Bacteriol., 171, 5872, 1989]; названный фрагмент был получен из рекомбинантной плазмиды pWHM 901 путем переваривания ферментами Sphl и Pvull. Карта, показанная на фиг.2, не должна рассматриваться как исчерпывающая иллюстрация всех рестрикционных сайтов, присутствующих в ДНК, однако сайты, показанные на фиг.2, являются достаточными для точного распознавания сегментов.

На фиг. 3, 4, 5, 6 схематически проиллюстрирована "нуклеотидная последовательность сегмента ДНК dnrK, кодирующего карминомицин-4-трансферазу. Этот сегмент соответствует области, расположенной между Sphl и Pvull - сайтами рестрикции плазмиды pWHM 902, и представляет собой кодирующую нить в направлении 5′→ 3′. Выведенная аминокислотная последовательность транслированной открытой рамки считывания, кодирующей карминомицин-4-O-метилтрансферазу, показана ниже нуклеотидной последовательности гена dnrK (SEQ, ID, N 1, SEQ ID N 2).

На фиг. 7 показана рестрикционная карта второй ДНК настоящего изобретения. Эта ДНК представляет собой вставку в рекомбинантной плазмиде pWHM 903, сконструированной путем инсерции Ndel/ECoRl - (1,4 кв) фрагмента ДНК, полученного из Spnl - фрагмента ДНК размером 5,8 кв плазмиды pWHM 901 с помощью сайтнаправленного мутагенеза, в Ndel и EcoRl-сайты плазмидного вектора экспрессии pT7-7 E. coli [Tabor и Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82, 1074, 1986].

Карта, показанная на фиг. 7, не должна рассматриваться как исчерпывающая информация относительно всех рестрикционных сайтов, присутствующих в данной ДНК, однако показанные на этой фигуре сайты являются достаточными для однозначного распознавания сегментов.

ДНК-вставки и рестрикционные фрагменты, используемые в настоящем изобретении, содержат ген (dnrK), кодирующий карминомицин-4-O-метилтрансферазу. Для данного экспрессируемого гена ДНК может иметь свою собственную последовательность, регулирующую транскрипцию, и, в частности, свой собственный промотор, который соответствующим образом соединен с данным геном, который распознается РНК-полимеразой хозяйской клетки. Альтернативно, ДНК-вставка или рестрикционный фрагмент могут быть лигированы соответствующим образом с другой регулирующей транскрипцию последовательностью, либо клонированы в вектор в соответствующем рестрикционном сайте, надлежащим образом расположенном возле регулирующей транскрипцию последовательности в указанном векторе.

ДНК-вставка или рестрикционный фрагмент, несущие ген карминомицин-4-O-метилтрансферазы, могут быть клонированы в вектор для клонирования рекомбинантных ДНК. Для этого может быть использован любой автономно реплицирующийся и/или интегрирующий агент. Обычно в качестве такого вектора используется плазмида. Предпочтительной плазмидой является многокопийная плазмида pWHM3 или plJ702 [Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129:2703, 1983]. Другими подходящими плазмидами являются plJ385 [Mayeri et al., J. Bacteriol. 172: 6061, 1990], plJ680 (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), pWHM601 [Guilfoile and Hutchinson. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. USA, 88:8553, 1991] или pPM927 [Smokina et al., Gene 94:52, 1990]. Для введения ДНК-вставки или рестрикционного фрагмента в вектор может быть использована любая подходящая техника. Указанная инсерция может быть осуществлена путем лигирования ДНК в линеаризованный вектор в соответствующем сайте рестрикции. Для этих целей может быть осуществлено прямое присоединение "липких" или "тупых" концов, присоединение гомополимера, либо могут быть использованы линкерная или адаптерная молекулы.

Рекомбинантный вектор используется для трансформации соответствующей клетки-хозяина. Эти клетки-хозяева могут быть как карминомицин- или даунорубицин-восприимчивыми (не могут расти в присутствии определенного количества карминомицина или даунорубицина), так и карминомицин- или даунорубицин-резистентными. Таким хозяином может быть микроорганизм. Поэтому могут быть трансформированы штаммы S.peucetius, в частности S.peucetius 29050, а также другие штаммы видов Streptomyces вне зависимости от того, продуцируют или не продуцируют они антрациклины. Трансформанты штаммов стрептомицетов обычно получают путем трансформации протопластов. Ген dnrK может быть также введен в другие векторы и экспрессирован в бактериях, не относящихся к стрептомицетам, например в E. coli. COMT-белок, полученный с помощью трансформированного хозяина, может быть использован для биоконверсии карминомицина в даунорубицин. Этот способ дает возможность получить даунорубицин высокой чистоты из клеточного экстракта, продуцированного путем ферментации и содержащего помимо даунорубицина нежелательный побочный продукт в виде карминомицина.

Процесс биоконверсии может быть осуществлен либо путем непосредственного использования свободных или иммобилизованных трансформированных клеток, либо путем выделения COMT-белка, который может быть использован как в свободной форме, так и будучи иммобилизован стандартными способами на полимере, стекле, целлюлозе или на аналогичных субстратах посредством ионной или ковалентной связи или привит к волокнам, проницаемым для субстрата, или иммобилизован посредством перекрестного сшивания. COMT-белок может быть использован и в виде неочищенного клеточного экстракта.

Рекомбинантный вектор настоящего изобретения может быть также использован для трансформации соответствующей хозяйской клетки, которая продуцирует даунорубицин, в целях усиления биоконверсии карминомицина и минимизации количества нежелательного промежуточного соединения, присутствующего в конечном клеточном экстракте. Эти хозяйские клетки могут быть карминомицин-, даунорубицин- или доксорубицин-резистентными, т. е. они могут расти в присутствии любого количества карминомицина, даунорубицина или доксорубицина. Поэтому могут быть трансформированы штаммы S.peucetius, в частности S.peucetius 29050, и другие штаммы стерптомицетов, продуцирующие антрациклины. Трансформанты штаммов стрептомицетов обычно получают путем трансформации протопластов. Даунорубицин может быть получен путем культивирования трансформированного штамма S.peucetius или других видов Streptomyces, которые не содержат гена dnrK с последующим выделением продуцированного таким образом даунорубицина или родственных антрациклинов.

ДНК-вставки для осуществления способа получения COMT получают из геномной ДНК S.peucetius 29050. Этот штамм был депонирован в Американской коллекции типовых культур [Роквилл, Мэриленд (MD) США] под номером АТСС 29050. Для этих целей может быть также использован штамм S.peucetius 27952, который происходит от S.peucetius 29050 и который также способен превращать карминомицин в даунорубицин.

Процедура получения ДНК-вставки включает:
(a) создание библиотеки геномной ДНК штамма S.peucetius 29050 или происходящего от него штамма;
(b) скрининг полученной библиотеки на наличие в ней клонов, способных превращать карминомицин в даунорубицин;
(c) изолирование ДНК-вставки из рекомбинантного вектора, который является частью библиотеки и который дал положительный результат при скрининге на способность к превращению карминомицина в даунорубицин; и
(d) необязательно получение из указанной ДНК-вставки рестрикционного фрагмента, содержащего ген, который кодирует карминомицин-4-O-метилтрансферазу.

Указанная в стадии (a) библиотека может быть получена путем частичного переваривания геномной ДНК штамма S.peucetius 29050 или происходящего от него штамма. Для этого предпочтительно использовать рестриктирующий фермент Mвol. Полученные таким образом ДНК-фрагменты могут быть подвергнуты фракционированию по размерам, причем предпочтительными являются размеры от 3 до 5 кв. Эти фрагменты лигируют в линеаризованный вектор, такой как pWHM3 или plJ 702. Хозяйские клетки трансформируют лигирующий смесью. Обычно хозяйские клетки могут не продуцировать карминомицин или даунорубицин и могут быть карминомицин- или даунорубицин-восприимчивыми, например они могут быть восприимчивыми к 10 мкг или менее карминомицина или дауномицина на 1 мл. В частности, могут быть трансформированы протопласты штамма S.lividans, Jl 623 (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985).

На стадии (b) полученные трансформанты скринируют на способность поглощать карминомицин, превращать его в даунорубицин и экскретировать этот даунорубицин. Клоны, способные превращать карминомицин в даунорубицин, идентифицируют с помощью хроматографического анализа экстрактов культуральной среды, содержащей карминомицин, проводимого в целях обнаружения даунорубицина в указанных экстрактах. Эти клоны выделяют и содержащиеся в них рекомбинантные векторы изолируют. После переваривания рекомбинантных векторов соответствующими рестриктазами на стадии (c) ДНК S.peucetius 29050, встроенная в каждый из векторов, может быть идентифицирована путем определения ее размера и картирована. Таким образом может быть установлено, что данный вектор содержит ДНК-вставку настоящего изобретения.

Кроме того, могут быть выделены две или несколько перекрывающих вставок, которые полностью или частично включены в ДНК настоящего изобретения. Эти вставки могут быть объединены вместе путем расщепления в их общем рестрикционном сайте и последующего лигирования в целях получения ДНК настоящего изобретения, которую, если это необходимо, урезают по длине соответствующими рестриктазами. Рестрикционные фрагменты ДНК-вставки, которые содержат ген, кодирующий COMT-белок, могут быть получены на стадии (d) также путем расщепления ДНК-вставки соответствующим рестрикционным ферментом.

Полученная ДНК может быть мутирована с использованием методов, не влияющих на ее способность сообщать признак, ответственный за превращение карминомицина в даунорубицин. Это может быть достигнуто, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Далее кодирующая последовательность ДНК может быть введена в векторы, подходящие для экспресии гена dnrK в хозяине, не относящемся к стрептомицетам, например в E.coli.

Представленные ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение
Материалы и методы.

Бактериальные штаммы и плазмиды. Штамм E.coli DH5α, который является восприимчивым к ампициллину и апрамицину, был использован для субклонирования ДНК-фрагментов, а штамм E. coli K38 (Russel & Modet, J. Bacteriol., 159, 1034, 1984) был использован для экспрессии гена dnrK S. peucetius. При получении однонитевой ДНК для секвенирования dnrK-гена был использован штамм E.coli JM105.

Среды и буферы. E coli DH5α выдерживали на LB-агаре (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2-е изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). При селекции на присутствие трансформантов добавляли ампициллин или апрамицин в концентрациях 50 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно. E. Coli JM 105 выдерживали на агаровой минимальной среде M9 (Sambrook et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2-е изд. Cold Sping Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), а колонии переносили на LB-среду и в течение ночи культивировали при 37oC в целях получения бактерий, используемых для продуцирования однонитевой ДНК. H-агар (Sambrook et al. Molekular Cloning. A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) использовали для культивирования E. coli DH52α, трансформированных репликативной формой ДНК M13 [Yansch-Perron et al. Gene, 33, 103, 1985]. S. lividans выдерживали на агаре R 2YE (Hopwood et al. , Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) для получения спор, а также для регенерации протопластов.

Субклонирование ДНК-фрагментов. ДНК-образцы переваривали соответствующими рестриктазами и подвергали разделению на агарозном геле стандартными методами (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Агарозные срезы, содержащие нужные ДНК-фрагменты, вырезали из геля и из них, используя устройство GENECLEAN (Biol01, La Jolla, CA), выделяли ДНК. С помощью традиционной техники (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) выделенные ДНК-фрагменты субклонировали в E. Coli- и E.coli / Streptomyces-челночные векторы для экспрессии и в векторы M13 [Yansch-Perron et al. Gene 33 : 103 1985] - для секвенирования.

Секвенирование ДНК
После субклонирования нужных ДНК-фрагментов в вектор M13 получали однонитевую ДНК с использованием стандартной техники (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и использовали при секвенировании. Данные о ДНК-последовательности были получены с использованием набора для секвенирования с секвеназой версии 2.0 (US Biochemicals, Cleveland, OH) в соответствии с инструкцией изготовителей. Во избежание компрессии, вместо dGTP использовали 7-Deala dGTP. Сначала для получения последовательности первых 200-250 оснований использовали универсальный праймер вектора M13, а затем из этой последовательности, используя ДНК-синтезатор Applied Biosystems 391 в соответствии с инструкцией изготовителей, синтезировали 17-мерный олигонуклеотид, который использовали в качестве праймера для дальнейшего секвенирования ДНК до тех пор, пока не будут получены данные о полной ДНК-последовательности.

Трансформация видов Streptomyces и E.coli. Компетентные клетки E.coli получали методом использования хлорида кальция (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Labaratory Manual, 2-е изд. Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, HY, 1989) и трансформировали их стандартными способами (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Мицелий S.Lividans TK24 культивировали в среду YEME (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) и через 48 ч собирали. Мицеллярные осадки дважды промывали 10,3% раствором сахарозы и использовали для получения протопластов способом, описанным в руководстве Horwood (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985). Осадки протопластов суспендировали примерно в 300 микролитрах P-буфера (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Labaratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), и 50-микролитровую аликвоту этой суспензии использовали для каждой трансформации. Протопласты трансформировали с помощью плазмидной ДНК в соответствии с методом мелкомасштабной трансформации Hopwood et al. (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985). После 17-часовой регенерации на среде R2YE при 30oC чашки покрывали 50 мкг/мл тиострептона и культивировали при 30oC до тех пор, пока не будут образовываться споры.

Биоконверсия карминомицина в даунорубицин. Трансформанты S. lividans, включающие в себя различные плазмиды, были инокулированы в жидкую среду R2YE (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), содержащую 5 мкг/мл тиострептона. После двухдневного культивирования при 30oC 2,5 мл этой культуры переносили в 25 мл среды Strohl [Dekleva et al., Can. J. Microbiol, 31:287, 1985], содержащей 20 мкг/мл тиострептона. Культуры выращивали в колбе Эрленмейера с перегородкой на роторном шейкере при 300 об/мин и при 30oC в течение 72 ч, после чего к культурам добавляли карминомицин (в виде водного раствора при концентрации 10 мг/мл) до получения конечной концентрации 5 мкг/мл. После дополнительного 24-часового инкубирования на шейкере культуры инкубировали в водяной бане при 60oC в течение 45 мин после добавления 150 мг/мл щавелевой кислоты для гидролиза гликозидных форм антрациклиновых метаболитов. Эти метаболиты экстрагировали из культур с использованием 15 мл хлороформа после того, как pH культур доводили до 8,4 - 8,6. Затем раствор хлороформа фильтровали через 0,45 мкм - Acrodisc CR-фильтр (Gelman Sciences, Ann Arbor-Ml) и 100 мкл этого фильтрата анализировали с помощью ВЭЖХ на кассете (8 мм х 10 см) с Water Nova-Pak C18 (подвижная фаза "метанол:вода", 85:15, доведенная до pH 2,5 путем добавления фосфорной кислоты; скорость потока 3 мл/мин). Выход колонки контролировали с помощью системы подачи, содержащей водный растворитель Water 6000 УФ-детектора 441, работающего при 254 нм, и модуля обработки данных 740. Для определения количества указанных метаболитов, выделенных из культур, в качестве внешних стандартов использовали карминомицин и даунорубицин (10 мкг/мл в метаноле).

Пример 1
Клонирование гена dnrK, кодирующего карминицин-4-О-метилтрансферазу
Несколько космидных клонов, описанных Stutzman-Engwall и Hutchinson [Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86, 3135, 1989] и представляющих собой геномную ДНК S.peucetius 29050 (приблизительно 96 кВ), трансформировали в S. lividans TK24 и полученные трансформанты анализировали на биоконверсию карминомицина в даунорубицин в соответствии с методом, описанным в главе "Материалы и методы" настоящей заявки. Космидный клон pWHM 339 [Otten et al. J. Bacteriol, 172, 3427, 1990] обеспечивал биоконверсию 22% добавленного карминомицина в даунорубицин. Eco Rl-фрагмент (11,2 к) из вставки в pWH 339 субклонировали в космидный вектор pKC 505 [Richardson et al. Gene, 61, 231, 1987], в результате чего получали плазмиду pWHM 534. S. Lividans TK 24, трансформированный плазмидой pWHM 534, обнаруживал 25 - 60%-ную биоконверсию добавленного карминомицина в даунорубицин.

Sphl-фрагмент (5,8 кв) из pWHM 534 субклонировали в Sphl-сайте высококопийной плазмиды pWHM3 и получали плазмиду pWHM 901. S. lividans, трансформированный плазмидой pWHM 901, обнаруживал 50 - 85%-ную биоконверсию карминомицина в даунорубицин. Sphl/Pvull-фрагмент (1,6 кв) клонировали из pWHM 901 сначала в Sphl,Smal-сайты pUC 19 [Yansch-Perron et al., Gene, 33, 103, 1985] , а затем этот ДНК-фрагмент размером 1,6 кв субклонировали из последней плазмиды в виде HindIII/Eco Rl-фрагмента в HindIII/Eco Rl-сайты pWHM3, в результате чего получали плазмиду pWHM 902 (фиг. 2). S.lividans, трансформированный с плазмидой pWHM 902, обнаруживал 100%-ную биоконверсию добавленного в культуру карминомицина в даунорубицин.

Область ДНК-последовательности, содержащая ген dnrK
Секвенирование ДНК-области размером 2,5 кв из Sphl-фрагмента (5,8 кв) в pWHM 901 осуществляли путем субклонирования Sphl/Xhol (0,4 кв), Xhol/Sstl (0,7 кв), Sstl/Sall (0,6 кв), Sall/Xhol (0,8 кв)-фрагментов из pWHM 902 в M 13 mp 18 и mp 19-векторы [Yansch-Perron et al., Gene, 33, 103, 1985] с получением обеих ориентаций каждого участка. ДНК-секвенирование полученных четырех клонов осуществляли, как описано в главе "Материалы и методы" настоящей заявки. Полученная ДНК-последовательность фрагмента ДНК (1,6 кв), содержащего dnrK-ген, и аминокислотная последовательность COMT-белка, выведенная путем анализа ДНК-последовательности с использованием программы CODON PREFERENCE, описанной Devereux и др. [Nucl. Acids Res., 12, 387, 1984], показаны на фиг. 3-6. Открытая рамка считывания dnrK, идентифицированная с помощью анализов CODON PREFERENCE и TRANSLATE [Devereux et al., Nucl. Acids. Res., 12, 387, 1984], кодирует COMT-белок.

Пример 2
Конструирование вектора экспрессии гена dnrK и E.coli
Sphl/Pvull-фрагмент ДНК, имеющий размер приблизительно 1,6 кв и содержащий полную открытую рамку считывания dnrK вместе с одной фланкирующей последовательностью (фиг. 3-6), субклонировали в Sphll и Smal-переваренную pUC 19 [Yansch-Perron et al., Gene, 33, 103, 1985], в результате чего получали плазмиду pWHM 904 (не показана). Затем, используя ДНК-синтезатор (Applied Biosystems 391) в соответствии с инструкциями изготовителей, синтезировали два олигодезоксинуклеотидных праймера, соответствующих последовательностям на обеих сторонах амплифицированного фрагмента, содержащего ген dnrK и представляющих собой

3-е положение второго, третьего и шестого кодонов (показанных жирным шрифтом) гена dnrK изменяли с использованием примера 1 для восстановления наиболее часто используемого кодона в высокоэкспрессируемых генах E.coli, что способствует усилению экспрессии гена dnrK в E.coli

Эти праймеры использовали для амплификации dnrK последовательности pWHM 904 от нуклеотида 205 (начало открытой рамки считывания dnrK до нуклеотида 445) (фиг. 3-6) с помощью стандартных методов, использующих полимерно-цепную реакцию с ДНК Streptomyces (см. , например, Guilfoile and Hutchinson, J. Bacteriol, 174; 3659, 1992); из амплифицированного продукта вырезали Ndel/Ncol-фрагмент (88 п.о.) и лигировали с Ncol/EcoRl-фрагментом (1,3 кв), полученным из pWHM 902, содержащим ген dnrK (фиг. 2 и 3-6), и с Ndel/EcoRl-переваренным вектором p T7-7 [Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82, 1074, 1985] , в результате чего происходило слияние открытой рамки считывания гена dnrK с промотором гена 10 T7 указанного вектора экспрессии E.coli.

Компетентные клетки DH5 E. coli трансформировали лигированной ДНК, а полученные трансформанты скринировали на pT7-7, содержащую dnrK. Сконструированную в результате плазмиду обозначали pWHM 903 (фиг. 7).

Экспрессия гена dnrK в E. coli
Компетентные клетки E.coli, содержащие плазмиду pGPl-2 [Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA], подвергали селекции на LB-агаре (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), содержащем ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл), после чего их культивировали при 30oC. Процедура получения компетентных клеток E.coli, содержащих p G31-2, в основном такая же, как и для любого другого штамма E.coli, за исключением того, что культуры клеток выдерживают при 30oC, а не при 37oC. Компетентные клетки E. coli, содержащие pGP1-2, получали из клеток, культивированных при 30oC до ОП550 = 0,5 - 0,6 в LB-среде, содержащей канамицин. Во избежание чрезмерной экспрессии РНК-полимеразы T7, что может привести к получению мутированной плазмиды, очень важно при обычном хранении и при предварительном культивировании штаммов, содержащих pGP1-2, поддерживать температуру 30oC.

Один трансформант, содержащий pGP1-2 и pWHM 903, инокулировали в 25 мл 2 х УТ-среды (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд. Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), содержащей 100 мг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30oC в течение ночи при энергичном размешивании. На следующее утро культуры подвергали резкому нагреванию до 42oC и инкубировали в течение 30 мин в водяной бане-шейкере, а затем снова переносили в условия температуры 30oC. После последующей 90-минутной инкубации 1 мл культуры центрифугировали 1 мин в микроцентрифуге при 14000 об/мин, супернатант отбрасывали, а клеточный дебрис ресуспендировали в 100 мкл буфера Лэммли (Laemmli, Nature (Лондон), 227, 680, 1970) и кипятили в течение 5 мин. Белки, содержащиеся в прокипяченном образце, анализировали в 10% ДСН-полиакриламидном геле, используя стандартную технику [Laemmli, Nature (Лондон), 227; 680, 1970] сравнения с белками, полученными из клеточного экстракта E.coli, трансформированной вектором pT7-7, не содержащим ген dnrK; COMT-белок мигрирует при M 38700.

Пример 3
Превращение карминомицина в даунорубицин клетками, содержащими COMT-белок
Один трансформант E.coli, содержащий pGP1-2 и pWHM 903, инокулировали в 25 мл 2 х УТ-среды, содержащей 100 мкг/мл и 50 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30oC в течение ночи, энергично размешивая при этом. На следующее утро культуры подвергали резкому нагреванию при 42oC в течение 30 мин в водяной бане-шейкере, а затем добавляли 5 мкг/мл карминомицина, снова переносили в условия 30oC. После этого культуры культивировали еще 90 мин, затем антрациклиновые метаболиты выделяли стандартными методами и анализировали с помощью ВЭЖХ. Сравнение соответствующих областей пиков сигналов для карминомицина и даунорубицина на ВЭЖХ-хроматограмме показало, что 75 - 80% карминомицина, добавленного в культуральную среду, превратилось в даунорубицин.

(2) Данные для последовательности SEQ 1D N 1
(1) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 1632 пар оснований
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двухцепочечная
(D) Топология: линейная
(11) Тип молекулы: ДНК (геномная)
(1Х) Отличительные особенности:
(A) Название/Ключ: CDS
(B) Локализация: 204. 1271
(Х1) Описание последовательности SEQ 1D N 1 приведено в конце описания
(2) Данные для последовательности SEQ 1D N 2
(1) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 356 аминокислот
(B) Тип: аминокислотная
(D) Топология: линейная
(11) Тип молекулы: белок
(Х1) Описание последовательности SEQ 1D N 2 приведено в конце описания
(2) Данные для последовательности SEQ 1D N 3
(1) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 67 пар оснований
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: одноцепочечная
(D) Топология: линейная
(11) Тип молекулы: ДНК
(Х1) Описание последовательности SEQ 1D N 3

(2) Данные для последовательности SEQ 1D N 4
(1) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 38 пар оснований
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: одноцепочечная
(D) Топология: линейная
(11) Тип молекулы: ДНК
(Х1) Описание последовательности SEQ 1D N 4
ACCGCTAGCC TGACGAGCTC CTCCGTACGG ACGTCCCC 38
(2) Данные для последовательности SEQ 1D N 5
(1) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 40 пар оснований
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: одноцепочечная
(D) Топология: линейная
(11) Тип молекулы: ДНК
ATGACCGCTG AACCGACCGT CGCGGCCCGG CCGCAGCAGA 40
(2) Данные для последовательности SEQ 1D N 6
(1) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 40 пар оснований
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: одноцепочечная
(D) Топология: линейная
(11) Тип молекулы: ДНК
(Х1) Описание последовательности SEQ 1D N 6
а

Похожие патенты RU2115731C1

название год авторы номер документа
ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ КАРМИНОМИЦИН-4-0-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, ВЕКТОР, ХОЗЯЙСКАЯ КЛЕТКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДАУНОРУБИЦИНА 1992
  • Чарльз Ричард Хатчинсон
  • Кришна Марти Маддури
  • Франческа Торти
  • Анна Луиза Коломбо
RU2155811C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА И СРЕДСТВА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 1996
  • Солари Инвенти Августо
  • Бреме Умберто
  • Коломбо Анна Луиза
  • Хатчинсон Чарлз Ричард
  • Оттен Шери
  • Скотти Клаудио
RU2205222C2
ФРАГМЕНТ ГЕНОМНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ УСТОЙЧИВОСТЬ К ДОКСОРУБИЦИНУ (ВАРИАНТЫ), И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 1989
  • Маринелла Карузо
  • Анна Луиза Коломбо
  • Луиза Гарофано
  • Франческа Торти
RU2118367C1
ПЕПТИДЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 1994
  • Паоло Комолио
  • Карола Понцетто
RU2146262C1
ФРАГМЕНТ ДНК, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД С АНТИТРОМБИНОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР (ВАРИАНТЫ) 1992
  • Паоло Сарментос
  • Филипп Де Таксис Дю Поет
  • Джампаоло Нитти
  • Эмануэла Скачери
RU2131462C1
СОПРЯЖЕННЫЕ С G-БЕЛКОМ РЕЦЕПТОРЫ DROSOPHILA, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ, ИМЕЮЩИЕ К НИМ ОТНОШЕНИЕ 2003
  • Лоуэри Дэвид Э.
  • Смит Валдин Г.
  • Кубяк Тереза М.
  • Ларсен Марта Дж.
RU2326385C2
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ 1-БУТАНОЛА 2006
  • Дональдсон Гейл К.
  • Хуан Лисуань Лиза
  • Мэджио-Холл Лори Энн
  • Нагараян Васантха
  • Накамура Чарльз И.
  • Сух Вончул
RU2429295C2
БЕЛОК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ 1992
  • Паоло Комольо
  • Тициана Крепальди
  • Мария Прат
RU2124024C1
ПРОТИВОЧУМНАЯ ВАКЦИНА 1996
  • Титболл Ричард Уилльям
  • Уилльямсон Этель Дайэн
  • Лиэри Софи Эмма Клэр
  • Ойстон Петра Клэр Фаркьюхар
  • Беннетт Элис Мари
RU2197988C2
СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК, КОДИРУЮЩЕГО α - СУБЪЕДИНИЦУ РЕЦЕПТОРА АДГЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТА L FA - 1 1989
  • Тимоти Спрингер[Us]
  • Ричард Ларсон[Us]
RU2051175C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 115 731 C1

Реферат патента 1998 года ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ КАРМИНОМИЦИН-4-О-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Полипептид, обладающий карминомицин-4-0-метилтрансферазной активностью с мол. м. 38700. Полипептид получен культивированием штаммов продуцентов Escherichia coli или Streptomyces. Штаммы трансформированы рекомбинантными плазмидами pWHM 901 или pWHM 902 или pWHM 903, содержащими фрагмент ДНК с установленной нуклеотидной последовательностью. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 7 ил.

Формула изобретения RU 2 115 731 C1

1. Полипептид, обладающий карминомицин-4-O-метилтрансферазной активностью, полученный культивированием штаммов Escherichia coli или Streptomyces, трансформированных рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагмент ДНК со следующей нуклеотидной последовательностью: и мол.м. 38700. 2. Способ получения полипептида, обладающего 4-O-метилтрансферазной активностью, заключающийся в культивировании штаммов-продуцентов Escherichia coli или Streptomyces, трансформированных рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью по п.1. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что рекомбинантными плазмидами являются pWHM 901, или pWHM 902, или pWHM 903.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1998 года RU2115731C1

Journal of Bacteriology, 1990, v
Приспособление для воспроизведения изображения на светочувствительной фильме при посредстве промежуточного клише в способе фотоэлектрической передачи изображений на расстояние 1920
  • Адамиан И.А.
SU172A1
Устройство для выгрузки шахтных обжигательных печей 1925
  • Иссерлис И.Л.
SU3427A1
Proc
Natl
Acad
Sci., 1988, v
Пюпитр для работы на пишущих машинах 1922
  • Лавровский Д.П.
SU86A1
Способ приготовления каучукового клея 1916
  • Государственный Трест Резиновой Промышленности
SU3135A1

RU 2 115 731 C1

Авторы

Чарльз Ричард Хатчинсон

Кришна Марти Маддури

Франческа Торти

Анна Луиза Коломбо

Даты

1998-07-20Публикация

1992-11-17Подача