ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ УСКОРЕННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ИЗ ОЧАГОВ ВНЕЛЕГОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ НА ОСНОВЕ СРЕДЫ ФИННА-II Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиобактериологии, и может быть использовано для культуральной диагностики туберкулеза внелегочной локализации.

Разработка методов ускоренного выделения микобактерий туберкулеза (МБТ) в целях диагностики туберкулеза является одной из важнейших проблем современной фтизиобактериологии. Особенно это относится к туберкулезу внелегочной локализации, где условия вегетации МБТ (ацидоз, анаэробиоз) отличаются от таковых при туберкулезе легких. Появление новых и модифицированных питательных сред для культивирования МБТ не учитывает эти особенности [1, 2, 3, 4]. МБТ имеют с своем составе значительное количество липидов, в том числе и ненасыщенных [5]. Известно, что эти липиды легко подвергаются окислению, что может привести к образованию токсичных для клеток МБТ перекисей липидов и продуктов их разложения. Возможно, такой процесс перекисного окисления липидов будет активнее протекать у тех типов микобактериальных клеток, которые размножаются в организме в условиях недостатка кислорода, т.к. у них менее развиты ферментные системы защиты.

Для конструирования питательных сред, адекватных условиям вегетации МБТ в туберкулезных очагах внелегочной локализации, перспективна модификации питательных сред со сниженным pH и добавлением веществ, уменьшающих концентрацию кислорода в среде.

Наиболее близкой к заявляемой среде является плотная яичная питательная среда Финна-II, поскольку она имеет более кислую реакцию (pH 6,3 - 6,5), чем общепринятые среды для культивирования МБТ [6]. Однако содержание кислорода в ней не отличается от стандартных питательных сред, что не защищает МБТ от токсичных перекисей липидов и продуктов их разложения.

Целью предлагаемого изобретения является создание в питательной среде условий, более адекватных вегетации МБТ в очагах туберкулеза внелегочной локализации и оптимальных стартовых возможностей для инициации роста микобактерий.

Цель достигается за счет того, что в питательную среду Финна-II добавляют натрий тиогликолевокислый, снижающий концентрацию кислорода в питательных средах, применяемых для выделения анаэробных микроорганизмов [7]. Преимуществом такой среды является создание более щадящих условий метаболизма МБТ, вегетирующих при недостатке кислорода.

Для экспериментальной проверки заявляемой среды были испытаны три варианта модифицированной питательной среды Финна-II с содержанием натрия тиогликолевокислого 0,015% - среда М-1, 0,05% - среда М-2, 0,15% - среда М-3. В опытах использовали химически чистый натрий тиогликолевокислый производства хим. завода им. Войкова.

Состав питательной среды.

Солевая основа:
сульфата магния - 0,5 г,
цитрата натрия - 1 г,
квасцов железоаммиачных - 0,05 г,
фосфата калия однозамещенного - 20 г,
цитрата аммония однозамещенного - 5 г,
натрия глутамата однозамещенного - 10 г,
глицерина - 20 мл,
воды дистиллированной - до 1000 мл.

Натрий тиогликолевокислый добавляли в солевой раствор в количестве:
0,15 г - среда М-1
0,5 г - среда М-2
1,5 г - среда М-3
Солевой раствор разливают в колбы по 300 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 2 мин. В стерильно приготовленную яичную массу из 12 яиц добавляют 10 мл 2% раствора малахитового зеленого и 300 мл стерильного солевого раствора. Фильтруют через марлевый фильтр, разливают по пробиркам (по 4 - 5 мл) и выдерживают для свертывания в скошенном положении при 85^oC 30 мин.

Для испытания модифицированной среды проведено 2460 параллельных посевов патологического материала (моча, гной, пунктаты натечников, лимфоузлов, биопсийный и послеоперационный материал) от больных туберкулезом почек, лимфоузлов, костей и суставов либо с подозрением на этот диагноз. Посевы по стандартной методике проведены на контрольную среду Финна-II и три варианта модифицированной питательной среды. Результаты проведенных исследований представлены в таблице.

При еженедельном просмотре посевов оказалось, что высеваемость МБТ в контроле и на модифицированных средах была одинаковой (2,8%). При 0,15% концентрации натрия тиогликолевокислого в среде не отмечено ускорения роста МБТ, и при этом значительно - на 46,2% снизилась массивность роста колоний. Минимальная концентрация тиогликолята натрия (0,15%) практически не влияла ни на скорость, ни на массивность роста МБТ. Наилучшие результаты получены на среде М-2 с содержанием натрия тиогликолевокислого 0,05%. Массивность роста колоний МБТ на этой среде существенно не отличалась от таковой в контроле, но у 22 культур МБТ (31,9%) отмечено ускорение роста на 5 - 7 сут.

Результаты идентификации штаммов, выделенных на контрольной и модифицированной средах, были идентичными, все выделенные культуры микобактерий были возбудителями туберкулеза человеческого вида.

Морфологические и тинкториальные свойства культур МБТ на модифицированных средах были не изменены. Следует отметить, что 0,15% содержание в среде натрия тиогликолевокислого не только ингибировало массивность роста МБТ, но и размер колоний был существенно меньше, чем в контроле и на средах М-1 и М-2.

Результаты определения лекарственной чувствительности культур МБТ, выделенных на контрольной и модифицированных средах, оказались идентичными как по количеству лекарственно-устойчивых штаммов - 14 (20,3%), так и по структуре лекарственной резистентности.

Таким образом, проведенные исследования показали, что добавление в среду Финна-II 0,05% натрия тиогликолевокислого в 31,9% приводит к ускорению на 5 - 7 сут роста культур МБТ при посеве патологического материала из очагов туберкулеза внелегочной локализации. По своим биологическим свойствам культуры МБТ на модифицированной среде не отличаются от таковых на контрольной среде Финна-II. Поэтому при культуральной диагностике туберкулеза внелегочной локализации целесообразно в имеющийся комплекс питательных сред включать модифицированную плотную среду с 0,05% содержанием натрия тиогликолевокислого.

Источники информации
1. Аникин В.А., Должанский В.М., Вальтер Ю.М. и др. Авт.св. СССР 575888. Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза. Бюл. Открытия, изобретения... 1979, N 24, с. 210.

2. Попеску Т.Т. Разработка питательных сред для микробиологической диагностики типичных и биологически измененных микобактерий туберкулеза. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 1990, 18 с.

3. Попкова Н. И., Ющенко А.А., Юрков В.А. и др. Особенности функционирования антиокислительной системы микобактерий, выращенных на средах, модифицированных перфтордекалином. Бюл. экспер. биол. мед., 1988, N 2, с. 187 - 189.

4. Самилло Г.К., Ромашева Е.П. Пути повышения высеваемости и ускорения роста микобактерий туберкулеза на модифицированной среде Финн-II. Пробл. туб, 1988, N 12, с. 62 - 63.

5. Вейсфейлер Ю. К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичных микобактерий. Будапешт, 1975, 335 с.

6. Методические рекомендации по изготовлению питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. М.: ВИЭВ, 1986, с. 45.

7. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. М.: 1950, 250 с.

Использование: биотехнология, культуральная диагностика туберкулеза внелегочной локализации. Сущность изобретения: условия вегетации микобактерий туберкулеза (МБТ) в очагах внелегочной локализации отличаются большим ацидозом и анаэробиозом, чем при туберкулезе легких, что требует создания питательных сред, более адекватных такой среде обитания. В солевой состав среды Финна-II с более низким pH, чем в других общепринятых питательных средах, вводят натрий тиогликолевокислый в количестве 0,5 г/л, который уменьшает концентрацию кислорода в среде. Высеваемость МБТ на контрольной среде Финна-II и модифицированной была одинаковой - 2,8%. Содержание в среде 0,05% тиогликолята натрия, не влияя на массивность роста МБТ, в 31,9% ускоряло рост МБТ на 5 - 7 сут. Биологические свойства МБТ на модифицированной среде не изменены. Предлагаемая питательная среда в комплексе с общепринятыми может быть использована в работе практических лабораторий для культуральной диагностики туберкулеза внелегочной локализации. 1 табл.

Питательная среда для ускоренного выделения возбудителя туберкулеза из очагов внелегочной локализации на основе среды Фина-II, отличающаяся тем, что дополнительно содержит натрий тиогликолевокислый в количестве 0,5 г/л.