ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВНЕЛЕГОЧНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/00 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиобактериологии, и может быть использовано для выделения возбудителя из очагов туберкулеза внелегочной локализации.

В связи с наметившейся в последние годы неблагоприятной тенденцией нарастания частоты туберкулеза внелегочной локализации особую остроту приобретает проблема его культуральной диагностики.

Выделение возбудителя из очагов внелегочного туберкулеза имеет ряд трудностей, связанных с особенностями вегетации микобактерии туберкулеза (МБТ) в условиях повышенного ацидоза и анаэробиоза [1]. Продолжающиеся исследования по совершенствованию питательных сред не учитывают эти особенности [2 - 5] , хотя проблема метаболической изменчивости МБТ остается одной из серьезнейших в фтизиобактериологии [6]. Наличие в составе МБТ большого количества липидов, в том числе ненасыщенных, легко подвергающихся окислению, может дать в результате накопление токсичных для микробных клеток продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [7]. По-видимому, одной из причин более скудного и замедленного роста МБТ из туберкулезных очагов внелегочной локализации является недостаточность ферментных систем защиты от токсичных продуктов ПОЛ у микробных клеток, вегетирующих в условиях повышенного анаэробиоза.

В целях конструирования питательных сред для культивирования возбудителя из туберкулезных очагов внелегочной локализации перспективно использование в качестве протекторов различных антиоксидантов, защищающих МБТ от токсичных перекисей липидов и продуктов их разложения.

Наиболее близкой к предлагаемой среде является плотная яичная питательная среда Финна-П с более кислой реакцией (pH 6,3 - 6,5), чем другие питательные среды для выделения МБТ [8]. Но в среде Финна-П также не содержится протекторов, способствующих адаптации метаболизма микробных клеток при переходе от повышенного анаэробиоза к аэробным условиям.

Целью изобретения является защита МБТ от токсичных продуктов ПОЛ.

Цель достигается за счет того, что в питательную среду Финна-П добавляют антиоксидант α - токоферола ацетат. Преимуществом такой среды является наличие в ней протектора, способствующего улучшению метаболизма МБТ в изменившихся при посеве условиях аэрации.

Для экспериментальной проверки были испытаны 4 варианта предлагаемой питательной среды. Содержание α -токоферола ацетата в питательной среде составляло 0,01 мкг/мл - среда A и 0,001 мкг/мл - среда A1 (см. таблицу). В качестве сравнения испытана модифицированная среда Финна-П с добавлением другого антиоксиданта - натрия тиосульфата также в концентрации 0,01 мкг/мл - среда T и 0,001 мкг/мл - среда T1 (см. таблицу). В опытах использовали α -токоферола ацетат производства Ленинградского химико-фармацевтического объединения "Октябрь" в виде 10%-ного стерильного масляного ампуллированного раствора и натрия тиосульфат производства Новосибирского ХФЗ в виде 30%-ного стерильного ампуллированного раствора.

Состав питательной среды.

Солевая основа, г:
Сульфат магния - 0,5
Цитрат натрия - 1
Квасцы железоаммиачные - 0,05
Фосфат калия однозамещенный - 20
Цитрат аммония однозамещенный - 5
Натрия глутамат однозамещенный - 10
Глицерин - 20 мл
Вода дистиллированная - До 1000 мл
Антиоксиданты добавляли в солевой раствор в количестве, г:
α -Токоферола ацетат - 0,00003 (среда A)
α -Токоферола ацетат - 0,000003 (среда A1)
Натрия тиосульфат - 0,00003 (среда T)
Натрия тиосульфат - 0,000003 (среда T1)
Солевой раствор разливают в колбы по 300 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин. В стерильно приготовленную яичную массу из 12 - 14 яиц (600 мл яичной массы) добавляют 10 мл 2%-ного раствора малахитового зеленого и 300 мл стерильного солевого раствора. Фильтруют через марлевый фильтр, разливают по пробиркам (по 4 - 5 мл) и выдерживают для свертывания в скошенном положении при 85^oC 30 мин.

Испытание питательной среды с антиоксидантами проведено на 2798 образцах патологического материала (моча, гной, пунктаты, соскоб эндометрия, периферические и мезентериальные лимфоузлы, содержимое очагов) от больных внелегочным туберкулезом различной локализации (костей и суставов, почек, лимфоузлов, гениталий) либо с подозрением на этот диагноз. Исследование по стандартной методике произведено на 4-х вариантах модифицированной питательной среды параллельно с посевом на контрольную питательную среду Финна-П и международную питательную яичную среду Левенштейна-Йенсена.

Суммарно на всех испытанных средах получено 92 культуры МБТ, т.е. высеваемость составляла 3,3%. Количество выделенных культур МБТ на различных питательных средах представлено в таблице.

Как видно из таблицы, наиболее низкая высеваемость МБТ отмечена на среде Левенштейна-Йенсена (69,6%). Количество культур МБТ, выделенных на среде Финна-П с добавлением различных концентраций натрия тиосульфата, практически не отличалось от результатов на контрольной среде.

Наиболее эффективной оказалось среда Финна-П, модифицированная добавлением α -токоферола ацетата в различных концентрациях. Количество культур МБТ, выделенных на обоих вариантах модифицированной среды, превышало рост МБТ на контрольной среде Финна-П. Из двух вариантов наилучшие результаты получены на среде с добавлением α -токоферола ацетата концентрацией 0,001 мкг/мл, где рост МБТ составил 92,4%, что на 14,2% превысило таковой в контроле.

Исследование культур МБТ, выделенных на контрольной и модифицированных средах, показало, что все они относятся к виду М. tuberculosis. Рост МБТ на контрольной и модифицированных питательных средах происходил в R-форме, морфологические и тинкториальные свойства культур МБТ, выросших на модифицированных средах, были не изменены. Результаты определения лекарственной устойчивости МБТ были идентичными по частоте и структуре.

Таким образом, использование антиоксидантов в качестве протекторов при выделении МБТ из очагов туберкулеза внелегочной локализации оказалось эффективным. Наилучшие результаты получены на питательной среде с α -токоферола ацетатом концентрацией 0,001 мкг/мл, где высеваемость МБТ на 14,2% превышала таковую в контроле. Это дает основание включать модифицированную среду Финна-П с 0,001 мкг/мл α -токоферола ацетата в комплексе питательных сред для культуральной диагностики внелегочного туберкулеза.

Источники информации:
1. Драбкина Р.О. Некоторые вопросы химиотерапии костносуставного туберкулеза. М.: 1969, с. 48-51.

2. Чичибабин Е. С. Совершенствование питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза. Проблемы туберкулеза 1990. N 5, с. 60-61.

3. Нуратинов Р.А., Халиков М.Х., Нажалов М.И. Высеваемость микобактерий на среде Финна-П в различной модификации. Бюл. ВНИИ экспериментальной ветеринарии. 1992, N 73-74, с. 54-57.

4. Попеску Т.Т., Бобейко А.С., Круду В.Н. Результаты бактериологических исследований на туберкулез с применением питательной среды B. Новое в организации и методах борьбы с туберкулезом и др. легочными заболеваниями. Молдов. НИИ профилактики и клинической медицины. Кишинев. 1992, с. 141 - 145.

5. Расулев А.Р., Наседкина Г.Г., Слободской А.Г. Результаты высеваемости микобактерий туберкулеза на различных питательных средах. Вопросы борьбы с туберкулезом и неспецифическими заболеваниями легких в Узбекистане. Сборник трудов. Ташкент, 1992, с. 171 - 174.

6. Аникин В.А. Особенности репродукции метаболически измененных микобактерий туберкулеза II (XII) съезд врачей-фтизиатров. Сборник резюме. Саратов, 1994, с. 227 - 228.

7. Арчаков В. Н. , Владимирский М.С. Перекисное окисление липидов. М.: 1972.

8. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Ред. Биргер М.О. М.: "Медицина", 1982, с. 79 - 80.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиобактериологии, и может быть использовано для культуральной диагностики туберкулеза внелегочной локализации. Предложена питательная среда, содержащая солевой состав питательной среды Финна-П. Дополнительно она содержит α-токоферола ацетат, который используется в качестве протектора, защищающего микробактерии туберкулеза из очагов внелегочной локализации от токсичных продуктов перекисного окисления липидов. Наилучшие результаты в опыте получены на питательной среде с включением α-токоферора ацетата концентрацией 0,001 мкг/мл. 1 табл.

Питательная среда для культуральной диагностики внелегочного туберкулеза, содержащая солевой состав питательной среды Финна-П, отличающаяся тем, что в качестве протектора, защищающего микобактерии туберкулеза из очагов внелегочной локализации от токсичных продуктов перекисного окисления липидов, она содержит дополнительно антиоксидант -α- токоферола ацетат при следующем соотношении компонентов, г:
Сульфат магния - 0,5
Цитрат натрия - 1
Квасцы железоаммиачные - 0,05
Фосфат калия однозамещенный - 20
Натрий глутамата однозамещенный - 10
Цитрат аммония однозамещенный - 5
α -Токоферола ацетат - 0,000003
Глицерин, мл - 20
Вода дистиллированная, мл - До 1000ю