СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 

Данное изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным методам диагностики туберкулеза.

Известные культуральные исследования диагностического материала традиционно осуществляются на плотных яичных средах. Существует большое количество плотных питательных сред и разные лаборатории используют различные среды. В настоящее время наиболее часто применяемой средой является питательная среда Финн-2 (приказ МЗ РФ №109 от 21. 03.03, стр.269).

Состав среды Финн-2 (в г/л):

1. Минеральные соли:

1.1. Магний сернокислый (MgSO₄×7H₂O) (ГОСТ4523-77)0,15 г1.2. Натрий лимоннокислый (С₆H₅О₇Na₃×5,5Н₂О) (ГОСТ 22280)0,3 г1.3. Квасцы железоаммонийные (Fe(NH₄)(SO₄)₂×12H₂O) (ГОСТ 4205-77)0,02 г1.4. Калий однозамещенный фосфорнокислый (КН₂PO₄) (ТУ-6-09-5324-87)6,0 г1.5. Аммоний лимоннокислый однозамещенный (С₆Н₁₁O₇N) (ГОСТ 7234-79)1,5 г1.6. Натрий глутаминовокислый однозамещенный(С₅Н₈NaO₄×Н₂О) (ТУ 6-09-337-70)3,0 г2. Глицерин С₃Н₈O₃6,0 мл3. Вода дистиллированнаядо 300,0 мл4. 2% раствор малахитового зеленого (C₃₅Н₅₄O₁₂N₄) (ТУ-6-09-1557-77)10 мл5. Яичная масса330 мл

Первичное культивирование микобактерий туберкулеза из диагностического материала затруднено тем, что существует ряд факторов, ограничивающих широкое применение культурального метода, в частности известные ограничения, связанные с медленным размножением микобактерий туберкулеза и их избирательное отношение к составу питательных сред. В связи с широким применением специфических противотуберкулезных препаратов наблюдаются изменения биологических свойств возбудителя, влияющее на способность микобактерий расти на питательных средах, что также снижает информативность культурального метода и диктует необходимость широкого поиска более совершенных питательных сред, которые позволили бы ускорить получение результатов и повысить эффективность и чувствительность метода. По данным микробиологической лаборатории ЯНИИТ, в 3,0-4,0% случаев из-за скудного роста культур МБТ не происходит накопления достаточной бактериальной массы для дальнейшей работы с выделенной культурой, возникает необходимость получения субкультур и, таким образом, удлиняются сроки выдачи результатов идентификации и определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

С учетом вышеперечисленного предложена питательная среда на основе яичной среды Финн-2, минеральные солевые компоненты последней растворяются в растворе гумата натрия, а не в дистиллированной воде.

Состав предложенной питательной среды (в г/л):

1. Минеральные соли:

1.1. Магний сернокислый (MgSO₄×7H₂O) (ГОСТ4523-77)0,5 г1.2. Натрий лимоннокислый (С₆H₅O₇Na₃×5,5Н₂O) (ГОСТ 22280)0,1 г1.3. Квасцы железоаммонийные (Fe(NH₄)(SO₄)₂×12Н₂O) (ГОСТ 4205-77)0,05 г1.4. Калий однозамещенный фосфорнокислый (КН₂PO₄) (ТУ-6-09-5324-87)20,0 г1.5. Аммоний лимоннокислый однозамещенный (С₆Н₁₁O₇N) (ГОСТ 7234-79)5.0 г1.6. Натрий глутаминовокислый однозамещенный (C₅H₈NaO₄×Н₂O) (ТУ 6-09-337-70)10,0 г2. Глицерин С₃Н₈О₃20,0 мл3. 0,1% раствор гумата натрия (C₃₉H₆₈O₂₆N₃)_n (pH 6,7)до 1000,0 мл

Приготовление питательной среды.

1. Приготовление 0,1% раствора гумата натрия.

Исходный раствор гумата натрия, полученный из сапропеля по общеизвестной методике, разводится стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 для получения 0,1% раствора. Необходимое количество раствора на 1 л яичной массы до 1000,0 мл рН не коррегируют. Срок хранения 3-4 недели при комнатной температуре.

2. Приготовление солевой основы питательной среды. При слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане в приготовленном 0,1% - 1000,0 мл растворе гумата натрия растворяют минеральные соли и глицерин по росписи среды Финн-2, в указанной последовательности. Автоклавируют при 1 атм. 30 мин рН не коррегируют. Срок хранения 3-4 недели при комнатной температуре.

3. Приготовление яичной массы.

Свежие диетические куриные яйца со сроком не более 7 суток, без трещин и дефектов скорлупы моют в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и мыла, оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе яйца разбивают стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л. Для этого требуется 20-25 яиц в зависимости от их величины. Тщательно взбивают стерильным венчиком.

4. Приготовление 2,0% малахитового зеленого. Раствор малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый - 2,0 г;

Стерильная дистиллированная вода- 100,0 мл.

Растворить в стерильной дистиллированной воде малахитовый зеленый, поместив раствор в термостат на 1-2 часа. Стерилизовать при 1 атм. 30 мин.

5. Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила стерильности, помещают растворы:

Раствор минеральных солей в 0,1% гумате натрия - 1000,0

Яичная масса - 1000,0

Тщательно перемешивают, фильтруют через 4-слойный марлевый фильтр.

Добавляют 30,0 мл 2,0% раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают в течение не более 15 мин, разливают в стерильные пробирки по 5,0.

6. Свертывание среды.

Свертывание среды проводят в специальных аппаратах при 85°С в течение 45 мин.

7. Питательные среды хранят в холодильнике, при температуре +4°С, в течение месяца.

Питательная среда, полученная предложенным способом, апробирована на музейных штаммах МБТ «Академия», «БЦЖ» и штаммах МБТ, выделенных от больных различными форами туберкулеза. Контролем служила стандартная питательная среда Финн-2 (Ф-2). Посев на пробирки со средами осуществляли путем внесения суспензии музейных культур, приготовленной по оптическому стандарту мутности - 500 млн. кл/мл в количестве 0,2 мл в каждую пробирку. Посевы клинических штаммов культур МБТ производили в разведении 50 млн. кл/мл в количестве 0,2 мл в каждую пробирку. Регистрировали: появление начального роста в сутках и массивность роста на 21 сутки наблюдения: до 20 колоний, от 20 до 50 колоний, от 50 до 100 колоний и более 100 колоний.

Способ иллюстрируется фиг.1-6.

Начальный рост МБТ «шт. Академия» на контрольной среде Ф-2 зарегистрирован на 10,6±0,5 сутки. В опытной среде на 8,1±0,4 сутки наблюдения (разница статистически достоверна р<0,005) (диаграмма 1).

Массивность роста учитывалась по количеству выросших колоний МБТ на 21 сутки наблюдения: от 50 до 100 колоний и более 100 колоний. На контрольной среде Ф-2 в 28,6% случаев дали рост от 50 до 100 колоний и 71,4% случаев более 100 колоний. В опытной среде регистрировалось следующее: рост от 50 до 100 колоний - не зарегистрирован; более 100 колоний - в 100% случаев (диаграмма 2).

Начальный рост МБТ «шт. БЦЖ» в контрольной среде Финн-2 зарегистрирован на 12,6±0,8 сутки, а в опытной среде на 6,9±0,5 сутки наблюдения (разница статистически достоверна р<0,001) (диаграмма 3).

Учитывалась массивность роста или накопление биомассы МБТ (шт. БЦЖ) на 21 сутки наблюдения: до 20 колоний, от 20 до 50, от 50 до 100 и более 100 колоний. Как видно из диаграммы 4, в контрольной среде Финн-2 в 35,7% массивность роста достигала до 20 колоний, в 35,7% рост от 20 до 50 колоний, в 28,6% массивность роста составляла более 100 колоний. В опытных средах в 35,7% рост от 20 до 50 колоний, в 14,3% от 50 до 100 колоний и в 50% случаях более 100 колоний (диаграмма 4).

Начальный рост штаммов МБТ, выделенных от больных различными формами туберкулеза, зарегистрирован на контрольной среде Ф-2 на 8,7±0,2 сутки наблюдения. В опытной среде начальный рост на 7,6±0,2 сутки наблюдения (диаграмма 5).

Массивность роста МБТ: на среде Ф-2 - до 20 колоний -10,6%; от 20 до 50 колоний - 56,1%; от 50 до 100 колоний-24,2%; более 100 колоний - 9,1%. В опытной среде до 20 колоний - 4,3%; от 20 до 50 колоний - 8,6%; от 50 до 100 колоний - 22,8% и более 100 колоний - 64,3% (диаграмма 6).

На основании проведенных исследований питательная среда, приготовленная предложенным способом, имеет ряд преимуществ:

1. Более выраженные питательно-ростовые свойства, что позволяет в 2,6 раза чаще получать массивный рост МБТ при малом числе микробных тел в посевном материале;

2. Длительное сохранение в пробирке конденсационной жидкости, что предохраняет среду от преждевременного засыхания;

3. Не содержит дорогостоящих компонентов.

Применение питательной среды, приготовленной предложенным способом:

1. Для культивирования возбудителя туберкулеза из диагностического материала человека и животных.

2. Для сохранения и выращивания лабораторных штаммов и выделенных культур микобактерий туберкулеза.

Описание гумата натрия

Гумат натрия - это водорастворимая форма ГВ, выделенных из озерных сапропелевых отложений. Обобщенная формула ГВ сапропеля может быть представлена как (C₃₉H₆₈O₂₆N₃)_n, где n - количество фрагментов. В составе гуминовых веществ в результате жесткого кислотного гидролиза обнаружены 16 аминокислот, главным образом, аспарагановая, глутаминовая кислоты, глицин, аланин, ряд углеводов, макро- и микроэлементы (азот, фосфор, калий, марганец, цинк и др.) (Мярикянов и др., 1991, Сазонов, 2000). Стандартность препарата достигается использованием сырья одного месторождения, постоянством цикла выделения. Применяемый для приготовления питательных сред исходный раствор гумата натрия (1%) представляет собой темнокоричневую вязкую жидкость, со специфическим запахом. Гумат натрия обладает способностью стимулировать биологические процессы в живых организмах и транспортировать к клеткам микроэлементы и другие ценные соединения. С учетом указанных характеристик предлагается использовать указанные биологически активные свойства гумата натрия при приготовлении питательных сред для выращивания микобактерий туберкулеза.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает смешивание солевой основы, состоящей из минеральных солей, с глицерином, растворение смеси солевой основы и глицерина, приготовление раствора малахитового зеленого, приготовление яичной массы и смешивание полученных растворов с яичной массой. При этом растворение смеси солевой основы и глицерина осуществляют в 0,1%-ном растворе гумата натрия, а компоненты берут в следующем количестве: магний сернокислый (MgSO₄×7Н₂О) 0,5 г, натрий лимоннокислый (C₆H₅O₇Na₃×5,5Н₂O) 0,1 г, квасцы железоаммонийные (Fe(NH₄)(SO₄)₂×12Н₂О) 0,05 г, калий однозамещенный фосфорнокислый (КН₂PO₄) 20,0 г, аммоний лимоннокислый однозамещенный (С₆Н₁₁О₇Н) 5,0 г, натрий глутаминовокислый однозамещенный (C₅H₈NaO₄×Н₂О) 10,0 г, глицерин (С₃Н₈O₃) 20,0 мл, 0,1% раствор гумата натрия (C₃₉H₆₈O₂₆N₃)_n до 1000,0 мл. В результате использования среды, приготовленной предложенным способом, достигается получение первой генерации культур МБТ на три дня раньше и увеличение биомассы в 2,1 раза по сравнению с контролем. 6 ил.

Способ получения среды для выращивания микобактерий туберкулеза, включающий смешивание солевой основы, состоящей из минеральных солей, с глицерином, растворение смеси солевой основы и глицерина, приготовление раствора малахитового зеленого, приготовление яичной массы и смешивание полученных растворов с яичной массой, отличающийся тем, что растворение смеси солевой основы и глицерина осуществляют в 0,1%-ном растворе гумата натрия, а компоненты берут в следующем количестве,:

Магний сернокислый (MgSO₄×7Н₂О)0,5Натрий лимоннокислый (C₆H₅O₇Na₃×5,5Н₂О)0,1Квасцы железоаммонийные (Fe(NH₄)(SO₄)₂×12H₂O)0,05Калий однозамещенный фосфорнокислый (КН₂PO₄)20,0Аммоний лимоннокислый однозамещенный (C₆H₁₁O₇N)5,0Натрий глутаминовокислый однозамещенный (C₅H₈NaO₄×H₂O)10,0Глицерин (С₃Н₈О₃), мл20,00,1%-ный Раствор гумата натрия (C₃₉H₆₈O₂₆N₃)_n, млДо 1000,0