ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано в медицине, в частности для высевания патологического материала и выращивания микобактерий при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота и человека.

В практике ветеринарных и медицинских лабораторий для бактериологической диагностики туберкулеза наиболее широко применяют плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Финн II, картофельная, "Новая" (Г.Г.Мордовский), среды 6 и 9, предложенные В.А.Аникиным и соавт. и т.д. Все перечисленные среды мало отличаются по химическому составу, физическим свойствам одна от другой и состоят из солевой основы с добавлением желтков куриных яиц. Соответственно, высеваемость и скорость роста микобактерий на разных средах незначительно расходятся в ту или иную сторону.

Недостатками данных питательных сред являются низкая высеваемость патологического материала и малая скорость роста чистых культур.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является среда, предложенная Г.К.Самилло и Е.Н.Ромашевой (1988), содержащая в качестве источника азота дрожжевой аутолизат и аммоний щавелевокислый, а в качестве источника углерода - глицерин в следующем составе:
магний сернокислый - 0,15 г
натрий лимоннокислый - 0,3 г
железоаммиачные квасцы - 0,015 г
калий фосфорнокислый 1 зам. - 6,0 г
щавелевокислый аммоний - 1,5 г
дрожжевой аутолизат - 3,0 мл
глицерин - 6 мл
дистиллированная вода - 300 мл
яйца куриные - 12 шт.

малахитовая зелень - 10 мл 2% р-ра
Недостатками данной среды являются низкий процент высеваемости из патологического материала и мокроты, малая скорость роста микобактерий. Кроме того, в процессе длительного термостатирования среда высыхает, в связи с чем прекращаются рост и размножение микобактерий. Это явление особенно проявляется при высеве гомогенатов биоматериалов на выделение микобактерий.

Целью изобретения является повышение эффективности использования питательной среды для выделения и выращивания микобактерий за счет изменения химического состава среды.

Поставленная цель достигается тем, что среда Финн II, содержащая в качестве источника азота глутаминовокислый натрий, аммония - цитрат однозамещенный, содержит в качестве источника азота дрожжевой аутолизат и аммоний щавелевокислый (Г.К.Самилло, Е.Н.Ромашева, 1988), дополнительно в качестве источника углерода - смесь Н-алканов в следующих количествах:
куриные яйца - 12 шт.

дрожжевой аутолизат - 30 мл
магний сернокислый - 0,15 г
натрий лимоннокислый - 0,3 г
железоаммиачные квасцы - 0,015 г
калий фосфорнокислый 1 зам. - 6,0 г
щавелевокислый аммоний - 1,5 г
глицерин - 6 мл
дистиллированная вода - до 300 мл
Н-алкилы (C₁₂-C₁₇) - 4-5 капель на поверхность среды в пробирке
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известной введением нового компонента, а именно Н-алканов (C₁₂-C₁₇) и количественным составом компонентов. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию "новизна". Анализ известных составов сред, используемых для выделения и выращивания микобактерий, показывает, что некоторые введенные в заявляемое решение вещества известны, например Н-алканы. Однако их применение в этих средах в сочетании с другими компонентами не обеспечивает средам такие свойства, которые они проявляют в заявляемом решении, а именно значительное обогащение легкоусвояемым азотом и углеродом плотной яичной среды с одновременным покрытием поверхности среды слоем жидкого парафина и, как следствие, длительное сохранение влажности среды в процессе термостатирования. Таким образом, данный состав компонентов придает среде новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию "существенные отличия".

Для экспериментальной проверки заявляемого состава среды были подготовлены 8 серий в различных вариантах, отличающиеся количественным содержанием добавляемых компонентов. Для этого предварительно готовили солевой состав, растворяли в теплой дистиллированной воде и стерилизовали при 1 атм. в течение 20 мин. Стерильный дрожжевой аутолизат добавляли к солевому раствору перед смешиванием со сбитыми яйцами. В стерильную колбу с бусами выливали 12 куриных яиц, встряхивали после добавления каждого яйца до образования однородной массы, доливали 10 мл 2% водного раствора малахитового зеленого и 300 мл приготовленного солевого раствора. Затем фильтровали через марлю, разливали по пробиркам и выдерживали в аппарате свертывания в наклонном положении при температуре 85^oC в течение 45 мин. Готовые серии сред засевали микобактериями разных видов лабораторных штаммов (одномоментно, из одного разведения бакмассы), одна из которых показала оптимальные результаты (см. табл. 1). В таблице представлены полученные свойства образцов сред с внесением различных соотношений компонентов и известных составов.

Из таблицы следует, что на предлагаемой среде (N 8) микобактерии лабораторных штаммов растут значительно быстрее, чем на всех остальных модификациях сред, в т.ч. чем на аналоге и прототипе (N 2, N 7).

Аналогичные результаты при посевах патматериала от животных и мокроты больных туберкулезом людей. Эти результаты отражены в таблице 2.

Таким образом, на предлагаемой среде сроки получения как первичной культуры, так и обильной бакмассы сокращаются на 15-20 суток. В то же время, на 16-19% повышается высеваемость микобактерий из патматериала от животных и почти в 2 раза из мокроты больных туберкулезом людей.

Использование заявляемой среды в бактериологии туберкулеза позволит ускорить постановку диагноза; за короткий срок получить обильную бакмассу; повысить высеваемость микобактерий из патматериала от животных и мокроты от больных туберкулезом людей; укоротить сроки термостатирования высеянных пробирок; исключить из состава среды остродефицитные ингредиенты.

Изобретение предназначено для бактериологической диагностики туберкулеза у животных и людей. Среда создана на основе модификации среды Финн-II. Среда обогащена легко усвояемым азотом и углеродом, исключены остродефицитные ингредиенты (глутаминово-кислый натрий, L-аспарагин). В качестве пленкообразующего вещества и дополнительного источника углерода в состав среды включен жидкий парафин (Н-алканы). Такое изменение состава среды позволило повысить как скорость роста, так и высеваемость микобактерий из патматериала от животных и мокроты от больных туберкулезом людей. 2 табл.

Питательная среда, используемая в бактериологии туберкулеза, содержащая куриные яйца, дрожжевой аутолизат, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железоаммиачные квасцы, калий фосфорнокислый однозамещенный, щавелевокислый аммоний, глицерин, малахитовую зелень и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит смесь H-алканов (C₁₂-C₁₇) с количественным составом ингредиентов:
Куриные яйца, шт. - 12
Дрожжевой аутолизат, мл - 30
Магний сернокислый, г - 0,15
Натрий лимоннокислый, г - 0,3
Железоаммиачные квасцы, г - 0,015
Калий фосфорнокислый однозамещенный, г - 6,0
Щавелевокислый аммоний, г - 1,5
Глицерин, мл - 6
Малахитовая зелень, 2%-ный раствор, мл - 10
Дистиллированная вода, мл - До 300
H-алканы, капель на поверхность среды в пробке - 4 - 5ш