ПРЕПАРАТ АБАКТАН-D ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ Российский патент 1998 года по МПК A61K31/00 A61K31/175 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и касается разработки препарата Абактана-Д (фосфонацетата пефлоксацина) для профилактики и лечения инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ, возбудитель - ДНК-содержащий вирус семейства Herpes viridae) и может быть использовано в птицеводческих хозяйствах и фермах, в научно-исследовательских учреждениях.

Известен способ профилактики и лечения ИЛТ изатизоном - 2% раствором метисазона в диметилсульфоксиде и полиэтиленгликоле-400, в соотношении 1:3 (Авт. св. СССР N 1086169 от 22.12.83 г. - прототип).

Однако метисазон - действующее вещество изатизона практически не растворим в воде, что ограничивает его применение, поскольку использование диметилсульфоксида и полиэтиленгликоля в качестве растворителей резко удорожает стоимость препарата. Кроме того, известно, что метисазон обладает только антивирусным действием (Миролюбова А.Н., 1990, Калныня В.А. и др., 1984), тогда как при ИЛТ, на фоне вирусной инфекции существенную роль в патогенезе и исходе болезни играет секундарная микрофлора (Барышев В.Д., 1992).

Предлагаемый препарат устраняет перечисленные недостатки.

Задача - разработать препарат с выраженной антивирусной и антибактериальной активностью, растворимый в воде и пригодный для профилактики и лечения ИЛТ.

Сущность предлагаемого препарата заключается в том, что для профилактики и лечения ИЛТ применяют новый химиопрепарат - Абактан-Д (фосфонацетат пефлоксацина), обладающий вирусстатическим, бактериостатическим и бактерицидным действием, хорошо растворимый в воде.

Фосфонацетат пефлоксацина.

Химическое название - 1-этил-6-фтор-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4дигидро-3- хинолинкарбоновая кислота, фосфонуксусная соль.

Эмпирическая формула: C₁₉H₂₅FN₃O₈P.

Молекулярная масса - 469,4.

Структурная формула:

Физическое состояние - бесцветные кристаллы, хорошо растворимые в воде.

Препарат применяется следующим образом.

1. Вирусстатическое действие фосфонацетата пефлоксацина в сравнении с прототипом изучают в культуре клеток (КК) с вирусами: болезни Ауески (ВБА, семейство герпесвирусов), африканской чумы свиней (АЧС, ДНК-содержащий вирус, семейство иридовирусов) и инфекционного ларинготрахеита птиц на 9-10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (КЭ), согласно "Методическим указаниям по отбору, испытаниям и оценке антивирусных химиопрепаратов", М., 1984.

Вирусстатическое действие определяли по разнице накопления титров вирусов в опыте по сравнению с контролем и выражали в lg ТЦД₅₀ (тканевых цитопатических доз) для вируса ВБА, в lg ГАЕ₅₀ (гемаглютинирующих единиц) для вируса АЧС, в процентах подавления БОЕ₅₀ (бляшкообразующих единиц) на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) КЭ для вируса ИЛТ.

Предварительно определяли максимально переносимую дозу (МПД) препаратов, а в ходе экспериментов минимально эффективную дозу (МЭД), и по ним вычисляли хомиотерапевтический индекс (ХТИ).

(ХТИ = МПД/МЭД)
В таблице 1 приведены результаты сравнительной оценки вирусстатического действия фосфонацетата пефлоксацина, мезилата пефлоксацина (коммерческого антибактериального препарата) и метисазона как прототипа, на вирусы ИЛТ, ВБА и АЧС.

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что фосфонацетат пефлоксацина в дозе 6000,0 мкг/кэ на 100% подавлял образование бляшек вирусом ИЛТ на ХАО куриных эмбрионов, а в дозе 1000,0 мкг/мл полностью подавлял репродукцию вирусов АЧС и ВБА в культуре клеток и имел ХТИ, равный 189,100 и 100 соответственно. Мезилат пефлоксацина даже в МПД не подавлял полностью репродукцию указанных вирусов, так же как и метисазон (прототип), который имел ХТИ, равный 2,25; 2,5 и 5,0 соответственно.

Антибактериальную активность фосфонацетата пефлоксацина и мезилата пефлоксацина изучали на жидких и твердых питательных средах с возбудителями сибирской язвы в споровой и вегетативной формах, колибактериоза и микоплазмоза согласно "Методическим указаниям по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней с/х животных" М - 1972 г. (4). В этих исследованиях метисазон как прототип не оценивали, так как известно, что он не обладает антибактериальной активностью.

В ходе экспериментов определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК), которые выражали в мкг/мл. В таблице 2 представлены результаты этих исследований.

Из данных таблицы 2 видно, что как фосфонацетат пефлоксацина. так и мезилат пефлоксацина проявляли выраженное ингибирующее и бактерицидное действие в отношении возбудителей сибирской язвы, колибактериоза и микоплазмоза. Разница в значениях МИК и МБК в 1,5 - 2,0 раза между фосфонацетатом пефлоксацина и мезилатом пефлоксацина объясняется тем, что молекулярная масса фосфонуксусной кислоты составляет 140, а метансульфоновой кислоты - 96, их соотношение составляет 1,46 к 1.

Испытание лечебно-профилактического действия фосфонацетата пефлоксацина проводили на цыплятах 45 - 50-дневного возраста, невакцинированных против ИЛТ, полученных из хозяйства, благополучного по инфекционным болезням птиц. Предварительно у 10% цыплят брали кровь и сыворотку исследовали на наличие антител, нейтрализующих вирус ИЛТ - результат отрицательный. Интактных к ИЛТ цыплят разделяли на 3 группы, две опытных группы по 20 голов в каждой и одна - контрольная 10 голов, каждую группу цыплят содержали в индивидуальных клетках в условиях вивария.

Опытных и контрольных цыплят заражали интратрахеально вирулентным вирусом ИЛТ штамма "Богатищевский" в дозе 60 - 100 ИД₅₀ (инфекционных доз), в объеме 0,5 мл. Фосфонацетат пефлоксацина давали с увлажненным кормом в дозе 100 мг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 10 дней. Цыплятам 1-й опытной группы препарат задавали одновременно с заражением (профилактический вариант применения), а цыплятам 2-й опытной группы через сутки после заражения - лечебный вариант. Цыплята контрольной группы препарат не получали.

Наблюдение за опытными и контрольными цыплятами проводили в течение 21 суток после прекращения применения препарата.

При проведении опыта учитывали заболеваемость цыплят, тяжесть, длительность течения болезни и выживаемость по группам. Оценку тяжести проявления болезни проводили по бальной шкале, разработанной в лаборатории: 0 - 5 баллов - слабая, 6 - 10 баллов - умеренная, 11 - 15 баллов - сильная, 16 - 19 баллов - тяжелая и 20 баллов - летальный исход.

В таблице 3 приведены результаты испытания на цыплятах лечебно-профилактического действия фосфонацетата пефлоксацина при ИЛТ.

Из данных таблицы 3 видно, что фосфонацетат пефлоксацина, задаваемый с кормом один раз в сутки в дозе 100 мг/кг массы тела в течение 10 дней, проявляет выраженное профилактическое и лечебное действие при ИЛТ. Препарат защищает от гибели 90% инфицированных цыплят, получавших фосфонацетат пефлоксацина с профилактической целью с момента заражения. При этом заболеваемость составила - 40%, тяжесть течения болезни - 7,4 балла, коэффициент защиты - 2,23.

При даче препарата, начиная со вторых суток после инфицирования (лечебный вариант применения), защита от гибели составляет 80%, заболеваемость 50%, тяжесть течения болезни - 8,4 балла, коэффициент защиты - 1,93.

В контрольной группе инфицированных цыплят заболеваемость ИЛТ составила 100%, тяжесть течения болезни - 16,5, летальность - 40%.

При изучении токсичности установлено, что ЭЛД₅₀ (эмбриональных летальных доз) фосфонацетата пефлоксацина для КЭ составляет 6,0 кг/мэ, а ЛД₅₀ (летальных доз) для белых мышей при внутривенном введении равна 2 мг на мышь или 100 кг/кг массы тела, при пероральном введении - 5000 мг/кг массы тела. Препарат не обладает эмбриотоксическим, тератогенным и иммунодепрессивным действиями, не влияет на воспроизводительную функцию птиц. Акт комиссионных испытаний, подтверждающий представленные результаты, имеется.

Таким образом, предлагаемый препарат Абактан-Д (фосфонацетат пефлоксацина) для профилактики и лечения инфекционного ларинготрахеита птиц эффективен, дешев, прост в исполнении и промышленно применим в птицеводческих хозяйствах. Препарат отечественного производства синтезируется из производимого в стране сырья.

Препарат Абактан-Д (фосфонацетат пефлоксацина) впервые синтезирован в Уральском политехническом институте академиком Чупахиным О.Н. и профессором Чарушиным В.Н., являющимися соавторами предлагаемого изобретения. Заявитель представляет описание способа, которым впервые получено это соединение.

Синтез Абактан-Д (фосфонацетат пефлоксацина) производится в два этапа по схеме:

Взаимодействием 1-этил-6,7-дифтор-4-оксо-дигидро-3- хинолинкарбоновой кислоты с N-метилпиперазинил в среде диметилформамида при 100-110^oC получена 1-этил-6-фтор-7(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидро- 3-хинолинкарбоновая кислота (пефлоксацин). Фосфонуксуснокислую соль пефлоксацина получают сливанием спиртовых растворов, пефлоксацина и фосфонуксусной кислоты. Строение полученных соединений подтверждено данными ЯМР¹H и ¹⁹F и элементным анализом.

Этап I. В круглодонную колбу емкостью 250 мл помещают 25,3 мл (0,1 моль) 1-этил-6,7-дифтор-4-оксо-1,4-дигидро-3-хинолинкарбоновой кислоты, 38,9 мл (35 г, 0,35 моль) N-метилпиперазина, 150 мл диметилформамида и нагревают с обратным водяным холодильником до 100-110^oC. Выдерживают при этой температуре 3 часа, охлаждают. Осадок отфильтровывают и кристаллизируют из диметилформамида. Получают 28,3 г (85%) 1-этил-6-фтор-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидро-3- хинолинкарбоновой кислоты.

Найдено, %: C - 61,1; H - 6,0; N - 12,4; C₁₇H₂₀FN₃O₃. Вычислено,%: C - 61,2; H - 6,0; N - 12,6. Температура плавления 270-272^oC. Спектр ЯМР¹H (CF₃COOD - CD₃OOD 1:1): 9,25 (1H, C, 2-H), 8,2 (1H, g 5-H), 7,45 (1H, g 8-H), 4,85 (2H, K, N - CH₂), 1,7 (3H, T, C-CH₃), 3,15 (3H, C, N -CH₃), 3,3-6,3 м. g. (8H, M, CH₂ - пиперид). ЯМР¹⁹F: 4,2 м.g. (1F, k, 6F). ИК-спектр: 1750 см^-1 (C = 0).

Этап II. В колбу емкостью 1 л помещают 33,3 мл (0,1 моль) 1-этил-6-фтор-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидро-3- хинолинкарбоновой кислоты, 500 мл этанола и при перемешивании приливают порциями спиртовой раствор 16,6 мл (0,12 моль) фосфонуксусной кислоты в 150 мл этанола. Перемешивают при комнатной температуре 1 час, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 2 • 50 мл этанола. Получают 38,6 г (78%) фосфонуксуснокислой соли 1-этил-6-фтор-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидро-3- хинолинкарбоновой кислоты (Абактан-Д, фосфонацетат пефлоксацина).

Найдено, %: C - 48,4; H - 5,4; N - 8,7; C₁₉H₂₅FNO₃P₈. Вычислено,%: C - 48,6; H - 5,4; N - 8,9. Температура плавления 293-295^oC. Спектр ЯМР¹H (CDCOOD - D₂SO₄ 10-1), 9,35 (1H, C, 2-H), 8,2 (1H, g 5-H), 7,55 (1H, g 8-H), 4,9 (2H, к, N - CH₂), 1,7 (3H, т, C-CH₃), 3,15 (3H, C, N -CH₃), 2,2-4,5 м.g. (10 H, м, CH₂), ЯМР¹⁹F: 48,4 м.g. (1F, k, 6-F).

Список использованной литературы
1. В. Д. Барышев - автореферат канд. дисс. Специфическая профилактика инфекционного ларинготрахеита в сочетании с химиопрепаратами. Покров, 1992.

2. А.Н. Миролюбова. Лечебно-профилактическая эффективность изатизона при инфекционном ларинготрахеите кур и его влияние на естественную резистентность, авт. реф. канд. диссертации, М., 1990.

3. В. А. Калныня, Р.Л. Фельдблюм, М.К. Индулен. Устойчивость вирусов к химиопрепаратам, Рига, 1984, с. 22-25.

4. Методические указания по отбору, испытаниям и оценке антивирусных химиопрепаратов. М., 1984.

5. Методические указания по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. М., 1972.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины и касается разработки нового химиотерапевтического препарата Абактана-Д (фосфонацетат пефлоксацина-C₁₉H₂₅FN₃O₈P). Новый химиопрепарат Абактан-Д обладает вирусстатическим, бактериостатическим, бактерицидным действием, хорошо растворимый в воде, и применяется для лечения и профилактики инфекционного ларинготрахеита птиц. Препарат эффективен, синтезируется из отечественного сырья, не обладает эмбриотоксическим, тератогенным и иммунодепрессивным действиями, не влияет на воспроизводительную функцию птиц. 3 табл.

Препарат Абактан-Д (фосфонацетат пефлоксацина) структурной формулы

обладающий вирусстатическим (ДНК-содержащие вирусы), бактериостатическим, бактерицидным действием для профилактики и лечения инфекционного ларинготрахеита птиц.