ШТАММ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА ХЛОПКОВОЙ СОВКИ Heliothis armigera Hbn, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2009 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок хлопковой совки (ХС), являющихся опасным вредителем хлопчатника и многих других культурных растений.

Применение биологических средств защиты растений является экологически оправданым. В отличие от химических средств защиты, этот вирус вызывает заболевание и гибель только личинок хлопковой совки, не оказывая вредного воздействия на другие виды животных (насекомых и позвоночных). Кроме того, стоимость получения вируса в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается сравнимой со стоимостью используемых в настоящее время химических пестицидов.

Известен ряд химических препаратов, применяемых для борьбы с хлопковой совкой. Например, известен препарат «Регент», однако он является химическим препаратом и оказывает негативное влияние не только на вредителей, но и на человека и теплокровных животных.

Известен штамм ВЯП Mamestra brassicae (Pd-1-5) ВКПМ virus-1, используемый для производства инсектицидного препарата против капустной совки (АС СССР №1638161, кл. C12N 7/00, опубл. 30.03.91). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма Pd-1-5 для гусениц Mamestra brassicae, составляет LD50 0,2×10⁵ полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма Pd-1-5 является низкая вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae и отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке Heliothis armigera Hbn.

Известен штамм ВЯП Mamestra brassicae (КС-3-86) ГКВ №2155, используемый для производства инсектицидного препарата против капустной совки (Патент РФ №2153258, кл. A01N 63/00, опубл. 27.07.2000). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма КС-3-86 для гусениц Mamestra brassicae, составляет (2,3-7,0)×10² полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма КС-3-86 является недостаточная вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae и отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке Heliothis armigera Hbn.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм ВЯП ХС-2, на основе которого получают препарат Вирин ХС-2 (ТУ 10.01.41-91). Он вызывает специфически направленную гибель хлопковой совки, безвреден для других животных, нетоксичен. Однако требует двухкратных обработок посевов. Эффективность достигает 77%.

Технической задачей изобретения является получение штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Heliothis armigera Hbn, используемого для получения инсектицидного препарата, который бы обладал большей вирулентностью по отношению к хлопковой совке по сравнению с прототипом.

Поставленная задача решается получением нового штамма вируса ядерного полиэдроза ХС-17 (авторское название), который задепонирован в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ "Вектор" (НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером VB-06.

Предлагаемый штамм ХС-17 выделен в результате селекции вируса, выделенного из гусениц, собранных на полях хлопчатника Таджикистана и погибших от спонтанного полиэдроза в лаборатории.

Стандартные условия культивирования: гусеницы хлопковой совки содержатся при температуре 28°С и влажности 60% на искусственной питательной среде (ИПС) следующего состава: мука люцерновая - 88 г, мука кукурузная - 35 г, дрожжи кормовые - 44 г, кислота аскорбиновая - 4,4 г, бензойная кислота - 2,0 г, агар - 15 мл, вода дистиллированная - до 1000 мл.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: штамм прошел 4 пассажа при заражении гусениц хлопковой совки лабораторной линии перорально.

Чувствительность к химическим веществам: чувствителен к эфиру, формалину, хлорамину, хлороформу; нечувствителен к ацетону.

Физико-химические свойства: размеры полиэдров (мкм) 1-3, размеры вирионов (нм) 400×80, нуклеокапсидов 310×50 нм. Тип включения вирионов - одиночный. ДНК кольцевая ковалентнозамкнутая, мол.вес 121,4 МД.

Рестрикционный анализ ДНК вируса: сайты рестрикции (количество) для PstI - 7, BamHI - 9, SlaI - 7.

Белковый состав вируса: 27 полипептидов. Мол.вес основных: от 64 до 18 МД.

Биологическая активность: LD50=1.336±0.314 (на гусеницах 3-го возраста хлопковой совки лабораторной популяции), ЛВ50=4.5 суток при заражении дозой ЛД90. Выход вируса при заражении гусениц 4-го возраста 1-6×10⁹ полиэдров на гусеницу.

Антигенные свойства штамма: преципитирующая активность антисывортки с гомологичным вирусом методом двойной иммунодиффузии составляет 1/32.

Способ хранения: штамм хранится при -30°С в сухой форме виде порошка белого цвета с титром не менее 2×10¹⁰ полиэдров/г.

Круг хозяев: хлопковая совка.

Патогенность для человека: непатогенен.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Технология получения вирусного препарата.

Технология производства вирусных препаратов осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и получение готового продукта.

Партию гусениц хлопковой совки по достижении ими третьей возрастной стадии инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм ХС-17). Для этого искусственную питательную среду (корм) опрыскивают вирусной суспензией штамма ХС-17 с титром 2×10⁵ полиэдров/мл и скармливают зараженный корм гусеницам ХС. Гусениц ХС содержат при 27±1,5°С и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 8-10 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают с помощью вакуумного насоса с давлением (8,7±0,1)×10⁴ Па в посуду из толстостенного стекла, добавляют раствор диэтилтиокарбоната натрия до конечной концентрации 0,1% и хранят при температуре от минус 5 до минус 10°С не более года. Для очистки вируса к биомассе из погибших гусениц добавляют дистиллированную воду и размельчают с помощью гомогенизатора. Полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя капроновой ткани с ячейками 0,1 мм, затем фильтрат осаждают центрифугированием. Осадок высушивают на лиофильной установке. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее 2×10¹⁰ полиэдров/г. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1×10¹⁰ полиэдров/мл.

Пример 2. Исследование токсичности и патогенности вирусного препарата на основе штамма ХС-17.

Проведена инфекционно-токсикологическая оценка препарата на основе штамма ХС-17. Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с "Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г." и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева, 1975 г. по испытанию безопасности бакуловирусов.

Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности препарата на мышах. 5 группам мышей (массой 18-20 г) по 10 в каждой вводили суспензию препарата в желудок и в брюшину из расчета по 1 мг препарата на 1 г веса. Контрольной группе вводили раствор 0,9% NaCl по 0,2 мл.

Введение дозы 1000 мг на 1 кг веса не приводит к гибели животных при введении в желудок. При внутрибрюшинном введении LD50 составляет 1000 мг/кг веса. При вскрытии погибших животных выявлено наличие уплотненного воспалительно-некротического очага, а также мелкие комковатые скопления введенного материала в брюшной полости (нерастворимые частицы наполнителя), у 20% животных отмечена увеличенная селезенка как следствие реакции на выведение кремнийсодержащих материалов. При этом термометрия, взвешивание, гематологические исследования живых мышей не выявили существенных отклонений от физиологической нормы. Серологические исследования, проведенные иммуноферментным и иммунофлуоресцентным методом, не выявили специфического бакуловирусного антигена ВЯП ХС в крови и органах животных на 28 день обследования.

Кожно-резорбтивное действие изучалось на гвинейских свинках при разовом и многократном нанесении препарата на основе штамма ХС-17, а также его действующего начала на неповрежденную и скарифицированную кожу. Контрольным группам наносили 0,9% NaCl.

Было установлено, что во всех случаях однократное нанесение не вызывало заметных местных или общих реакций у животных при воздействии всеми испытуемыми материалами. Также не выявлено отклонений от показателей в опытных группах при термометрии или взвешивании животных в течение 14 дней. Многократное нанесение на скарифицированную кожу сопровождалось местной реакцией раздражения, которое проходило через 4-5 дня после окончания воздействия.

Изучение раздражающего действия препарата на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюнктивитов. Выздоровление наступало через 5-7 дней после последнего воздействия. Повреждений роговицы и повышения температуры не отмечено.

Инфекционная оценка препарата проведена на теплокровных. Исследования проводили на культуре клеток эмбриональной ткани человека (ЧЭТ). Культуры инфицировали вирионами ВЯП ХС по 0,02 мл на пробирку с титром 1/512 по ИФА. Было проведено 7 пассажей патогенов. С помощью ИФА и ИФ-метода выявляли возможную адаптацию или репродукцию вируса. Установлено, что инфицирование ЧЭТ вирионами ВЯП ХС не приводит к цитопатическим изменениям монослоя клеток. В процессе пассажей исходного материала специфический антиген в культурах не выявлялся.

Проводили инфицирование лабораторных животных различного возраста при разных способах введения (в желудок, в нос, в брюшину, в вену, под кожу) суспензией полиэдров или вирионов ВЯП ХС. С помощью специально разработанных тест-систем определяли динамику антигенов в крови и внутренних органах испытуемых животных методами ИФА и РИФ. В результате проведенных исследований установлено, что вирусный антиген в крови и во внутренних органах теплокровных животных не накапливается и обычно элиминируется из организма к 7-14 дню после введения. Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы.

Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности вирусного препарата на основе штамма ХС-17 показали, что препарат можно отнести к малотоксичным веществам (четвертая группа по гигиенической классификации). ЛД50 при введении в желудок лежит за пределами 2500 мг/кг, при внутрибрюшинном - за пределами 1000 мг/кг. Действующее начало препарата ВЯП ХС-17 нетоксично для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.

Пример 3. Испытание опытных образцов вирусного препарата на основе штамма ХС-17.

Испытания проведены в фермерском хозяйстве Дилфуза-Хасанбай-Зухрахол Чартакского района Наманганской области согласно «Методическим указаниям по испытанию инсектицидов, акарицидов, моллюскоцидов в растениеводстве, Москва, 1986» и «Методическим указаниям по испытанию инсектицидов, акарицидов, биологически активных веществ и фунгицидов, Ташкент, 2004». Посев хлопчатника сорт С-65-24 произведен 10 апреля 2007 года. Высота стояния 85-90 см. Густота - 8-9 растений в 1 погонном метре.

Препарат использовался с титром 2×10¹⁰ полиэдров/г в виде водного 0,02%-ного раствора с глицерином. Всего обработана территория площадью 10 га. Расход препарата составил 40 г/га. Всего израсходовано препарата 800 г. Обработка проводилась при помощи ручного опрыскивателя К-90 и тракторного опрыскивателя ОВХ-28.

В процессе испытаний установлено: гибель насекомых наступала через 7-10 суток после обработки. При обследовании гусениц ХС через 7 суток обнаружено, что процент их гибели составляет 75%, а при последующем обследовании через 11 суток - 92%.

Биологическая эффективность препарата на основе штамма ХС-17 составляет 88-92%.

Пример 4. Сравнительные данные биологической активности заявляемого штамма ХС-17 штаммов-аналогов.

Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал на основе известных штаммов Pd-1-5, КС-3-86 и заявляемого штамма ХС-17.

Биологическую активность штаммов вирусов оценивали путем определения величины LD50 - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и LT50 время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 10⁷ полиэдров/гусеницу (пэ/гус). Расчет проводили по методу Кербера, гибель насекомых определяли с поправкой по формуле Аббота (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, с.82-93). Данные приведены в таблице.

Таблица Наименование штамма Биологическая активность, LD50 % разведения штамма Полиэдры/1 гусеница ХС-17 0,003 (1-2)×10² КС-3-86 0,003 (2,3-7,0)×10⁴ Pd-1-5 0,003 0,2×10⁵ Примечание. Процент разведения стандарта штамма (1×10⁹ полиэдров в 1 мл, a LT50 по каждому штамму находится в интервале 7-8 суток.

Анализ таблицы показывает, что заявляемый штамм ХС-17 позволяет получить вирусный инсектицидный препарат, который патогенен для гусениц ХС Heliothis armigera Hbn, причем по своей активности превышает инсектициды, полученные на основе известных штаммов Pd-1-5, КС-3-86 и ХС-2.

Препарат на основе предлагаемого штамма ВЯП ХС-17 удобен для применения в производственных условиях с использованием любых существующих марок мелкодисперсных опрыскивателей, является экологически чистым и обладает избирательным действием к целевому насекомому - хлопковой совке Heliothis armigera Hbn.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии. Штамм ХС-17 выделен в результате селекции вируса, выделенного из гусениц, собранных на полях хлопчатника Таджикистана и погибших от спонтанного полиэдроза в лаборатории. Штамм ВЯП ХС-17 задепонирован в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ "Вектор" под регистрационным номером VB-06. Биологическая активность штамма ХС-17 составляет (1-2)×10² полиэдров на 1 гусеницу, а биологическая эффективность препарата на основе штамма ХС-17 составляет 88-92%. Штамм может быть использован для производства биологических инсектицидов для сельского хозяйства. 1 табл.

Штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Heliothis armigera Hbn, НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» VB-06, используемый для получения инсектицидного препарата.