ШТАММ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА КАПУСТНОЙ СОВКИ MAMESTRА ВRASSICAE L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2000 года по МПК A01N63/00 C12N7/00 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок капустной совки (КС), являющихся опасным вредителем капусты и некоторых других сельскохозяйственных культур.

ВЯП КС может быть использован как активная основа энтомопатогенного препарата для подавления вспышек массового размножения капустной совки Mamestra brassicae L. Применение подобного препарата является экономически и экологически оправдано, поскольку, во-первых, стоимость препарата, созданного на основе ВЯП КС, в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается ниже, чем стоимость используемых в настоящее время химических пестицидов; во-вторых, вызывая заболевание и гибель только личинок капустной совки, он не оказывает вредного воздействия на другие виды животных (насекомых и позвоночных).

Известен штамм S-13-p ВЯП Mamestra brassicae, используемый для производства вирусного инсектицидного препарата против капустной совки Вирин-ЭКС и полученный путем адаптации ВЯП ивовой водянки к КС [1]. Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма S-13-р для гусениц Mamestra brassicae, имеет ЛК₅₀ 4 • 10⁵ полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма S-13-р ВЯП является низкая вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм ВЯП Mamestra brassicae (Pd-1-5) ВКПМ virus-1, используемый для производства инсектицидного препарата против капустной совки [2]. Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма Pd-1-5 для гусениц Mamestra brassicae, имеет ЛК₅₀ 0,2 • 10⁵ полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма-прототипа Pd-1-5 [2], также как и аналога [1], является низкая вирулентность по отношению к капустной совке Mamestra brassicae.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого нового штамма ВЯП Mamestra brassicae L. для производства инсектицидного препарата, который бы обладал большей вирулентностью по отношению к капустной совке по сравнению с аналогами [1, 2].

Указанная задача решается путем получения нового штамма ВЯП КС-3-86 (авторское название), который задепонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 2155.

Родословная штамма: штамм КС-3-86 получен в результате отбора естественных штаммовых вариантов. Штамм прошел 8 пассажей на гусеницах капустной совки при заражении перорально и интралимфально.

Стандартные условия культивирования: личинки капустной совки инкубируют при температуре 20^oC, влажности 60%, фотопериоде 16 часов. Состав искусственной питательной среды (ИПС): кормовые дрожжи 20-40 г, мука кукурузная 60-90 г, мука соевая 10-25 г, кислота аскорбиновая 3-5 г, агар-агар 5-7 г, метабен 1 г в 10 мл 96% спирта, формалин 10% - 4 мл, H₂O - до 500 мл.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: штамм прошел 8 пассажей на гусеницах капустной совки при заражении перорально и интралимфально.

Чувствительность к химическим веществам: чувствителен к эфиру, формалину, хлорамину, хлороформу, дезоксихолату; нечувствителен к ацетону.

Физико-химические свойства: размеры полиэдров 1.6-3.8 мкм; размеры вирионов 400х30 нм; количество нуклеокапсидов в пучке 4-5; ДНК кольцевая, ковалентнозамкнутая, М.в. 80 мегадальтон.

Рестрикционный анализ ДНК вируса: сайты рестрикции (количество) для Hind III - 14; Eco RI - 12; Bam HI - 11; Pst I - 30,
Белковый состав вируса: 28 полипептидов.

Биологическая активность: lgLD₅₀ = 2.6 ± 0.23 (4 • 10 ² полиэдров/мл); LT₅₀= 7.5 суток (биологическая активность штамма оценивалась при инфицировании гусениц капустной совки третьего возраста оренбургской, тюменской и московской популяций).

Антигенные свойства штамма: преципитирующая активность антисыворотки с гомологичным вирусом методом двойной иммунодиффузии составляет 1/32.

Способ хранения: штамм хранится при -30^oC в виде очищенных и лиофильно высушенных при -20^oC полиэдров.

Круг хозяев: личинки капустной совки.

Патогенность для человека: непатогенен.

На чертеже показана схема получения препарата.

Далее следуют примеры осуществления данного изобретения.

Пример 1. Технология получения вирусного инсектицидного препарата
Технология производства вирусных препаратов осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и получение готового продукта.

На чертеже представлена схема получения вирусного препарата.

Партию гусениц капустной совки по достижении ими четвертой возрастной стадии инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм КС-3-86). Для этого искусственную питательную среду (корм) опрыскивают вирусной суспензией штамма КС-3-86 (ГКВ N 2155) с титром 1-2 • 10⁷ полиэдров/мл и скармливают зараженный корм гусеницам КС. Гусениц КС содержат при 28 ±1^oC и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 11-12 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают и замораживают при минус 20^oC в течение 18 часов, лиофилизируют и переносят в аппарат для удаления волосков, являющихся сильным аллергеном. Аппарат представляет собой специальный барабан для стряхивания волосков, которые затем удаляют посредством вакуумной системы. Лишенные волосков лиофилизированные гусеницы размалывают для получения сухого вирусного порошка. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее (2-5)•10⁹ полиэдров/г. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1•10⁹ полиэдров/мл. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет (1,1 ± 0,3) мл/га.

Пример 2. Исследование токсичности и патогенности вирусного препарата на основе штамма КС-3-86 (ГКВ N 2155)
Проведена инфекционно-токсикологическая оценка препарата на основе штамма КС-3-86 (ГКВ N 2155) в КНИИЭИБ Минздрава УССР (Зав. лабораторией медицинской оценки вирусных инсектицидов, д.м.н., профессор В.Л.Васильева). Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с "Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г.", и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева 1975 г. по испытанию безопасности бакуловирусов.

Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности препарата на мышах. 5 группам мышей по 10 в каждой вводили суспензию препарата в желудок и в брюшину из расчета по 1 мг препарата на 1 г веса, а в контрольной группе - внутрибрюшинно.

Введение дозы 1000 мг на 1 кг веса не приводит к гибели животных при введении в желудок. Внутрибрюшинное введение вызывало гибель отдельных животных. При вскрытии обнаружены кремнийсодержащие конгломераты в месте введения и частично в брюшной полости. Гибель животных вызвана токсичным действием наполнителей. При внутрибрюшинном введении LD₅₀ находится за пределами 1500 мг/кг, что по гигиенической классификации токсичности пестицидов расценивается как малотоксичное вещество (4 группа).

Кожно-резорбтивное действие изучалось на морских свинках при разовом и многократном воздействии препарата на основе штамма КС-3-86, а также его действующего начала на неповрежденную и скарифицированную кожу. Однократное или многократное нанесение препарата на неповрежденную кожу каких-либо заметных реакций на месте введения или в организме животных не вызывало. На скарифицированной коже однократное нанесение реакций не вызывало, а в процессе многократного воздействия отмечалось местное раздражение, которое исчезало через 2-3 дня после окончания воздействия.

Изучение раздражающего действия препарата на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюнктивитов. Выздоровление наступало через 5-7 дней после последнего воздействия.

Инфекционная оценка препарата проведена на теплокровных. Для осуществления экспериментов предварительно изготавливают специфические ингредиенты: гипериммунные кроличьи сыворотки против ВЯП КС, выделяют IgG на их основе, разрабатывают и получают эритроцитарные диагностикумы для использования в иммунологических реакциях РПГА и РОПГА.

Эксперименты проводили на белых мышах 18-20 г, которым вводили суспензию полиэдров ВЯП КС в желудок, внутрибрюшинно и интраназально по 0,2, 0,5 и 0,4 • 10⁹ полиэдров/мл соответственно. Контрольной группе вводили по 0,5 мл физраствора в брюшину. Животных термометрировали и в динамике исследовали сыворотку крови на наличие антител и антигена во внутренних органам животных.

Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы. С помощью РПГА в сыворотках крови выявляли антитела в невысоких титрах на 5-й, 7-9 дни при всех способах введения. У животных с помощью РОПГА выявляли специфический бакуловирусный антиген в постепенно убывающих количествах до 7 суток. Такая динамика подтверждает активную элиминацию антигена из организма и отсутствие репродуктивного процесса.

Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности вирусного препарата на основе штамма КС-3-86 (ГКВ N 2155) показывает, что препарат можно отнести к малотоксичным веществам по гигиенической классификации (LD₅₀ более 1000 мг/кг). Действующее начало препарата ВЯП КС-3-86 не токсично для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.

Пример 3. Испытание опытных образцов вирусного препарата на основе штамма КС-3-86 (ГКВ N 2155)
Испытания проведены в садах совхоза Люберецкий Киевской области и Бобровицкого МПП Черниговской области против капустной совки Mamestra brassicae L. согласно методическим указаниям [3]. Препарат использовался с титром 5 • 10⁹ полиэдров/г в виде водного 0,1%-ного раствора с ПАВ ОП-7. Всего обработано территории площадью 369,9 га. Расход препарата составил 10-15 г/га. Всего израсходовано препарата 1800-2000 г. Обработка проводилась при помощи моторного ранцевого опрыскивателя F-320.

Численность гусениц до обработки оценивалась в соответствии с методическими указаниями [3].

В процессе испытаний установлено: гибель насекомых наступала через 7-12 суток после обработки. При обследовании гусениц КС через 10 суток обнаружено, что процент их гибели составляет 32,5%, а при последующем обследовании через 15 суток - 71,4%.

Биологическая эффективность препарата составляет (95,3-99,0)%.

Препарат удобен для применения в производственных условиях с использованием любых существующих марок мелкодисперсных опрыскивателей, является экологически чистым и обладает избирательным действием к целевому насекомому - капустной совки Mamestra brassicae L.

Пример 4. Сравнительные данные биологической активности заявляемого штамма КС-3-86 и штаммов-аналогов [1, 2].

Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал на основе известных штаммов S-13-p [1] и Pd-1-5 [2] и заявляемого штамма КС-3-86.

Биологическую активность штаммов вирусов оценивают путем определения величины LD₅₀ - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и LT₅₀ время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 10⁷ полиэдров/гусеницу (пэ/гус). Расчет проводят по методу Кербера, гибель насекомых определяют с поправкой по формуле Аббота [4].

Данные приведены в таблице.

Примечание. Процент разведения стандарта штамма (1 • 10⁹ полиэдров в 1 мл).

LT₅₀ по каждому штамму находится в интервале 7-8 суток.

Анализ таблицы показывает, что заявляемый штамм КС-3-86 позволяет получить вирусный инсектицидный препарат, который патогенен для гусениц КС Mamestra brassicae L. (Mamestra brassicae), причем по своей активности на два порядка превышает инсектицид, полученный на основе известных штаммов S-13-p [1] и Pd-1-5 [2].

Промышленная применимость. Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к производству вирусных инсектицидных препаратов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в сельском хозяйстве. Сб., М., 1984. - с. 3-14).

2. Авторское свидетельство СССР N 1638161, МКИ C 12 N 7/00, опубл. 30.03.91.

3. Методические указания по применению вирусного препарата Вирин-КС в защите сада от капустной совки - Киев, 1988 г.

4. Ашмарин И. П., Воробьев А.А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, с. 82-93.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок капустной совки (КС). Штамм ВЯП КС-3-86 получен в результате отбора естественных штаммовых вариантов и прошел 8 пассажей на гусеницах капустной совки при заражении перорально и интралимфально. Штамм ВЯП КС-3-86 задепонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ N 2155. Данный штамм позволяет получить вирусный инсектицидный препарат, который по своей активности на два порядка превышает инсектицид, полученный на основе известных штаммов ВЯП S-13-p и Pd-1-5. 1 ил., 1 табл.

Штамм вируса ядерного полиэдроза капустной совки MAMESTRA BRASSICAE L. ГКВ N 2155, используемый для получения инсектицидного препарата.