СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКА ГЕНТАМИЦИНА Российский патент 1998 года по МПК C07H15/234 

Описание патента на изобретение RU2119495C1

Изобретение относится к области медицинской промышленности, конкретно касается усовершенствования способа выделения антибиотика гентамицина.

Гентамицин представляет собой смесь (гентамицин C-комплекс), состоящую из трех основных компонентов C1a; C2; C1, содержание которых в комплексе строго нормировано (согласно кодекса Федеральных правил США FDA-78 содержание C1a - 15 - 40%; C2 - 20 - 50%; C1 - 25 - 50%).

В процессе биосинтеза гентамицина в ферментационной жидкости наряду с его основными компонентами продуцируются сходные с ним родственные примеси - минорные компоненты, которые сопутствуют целевому продукту при его извлечении из этой ферментационной жидкости. Содержание минорных компонентов в готовом препарате гентамицина в зависимости от способов очистки достигает 5 - 30%.

Удаление этих примесей из комплекса гентамицина необходимо вследствие возможных нежелательных свойств этих примесей и их низкой биологической активности. Кроме того, присутствие в препаратах гентамицина минорных компонентов не позволяет получить целевое вещество со стандартными качественными характеристиками. Отделению этих примесей от основного комплекса гентамицина, связанному с большими трудностями, посвящен ряд исследований.

Известны способы очистки комплекса гентамицина путем сорбции из нативного раствора - отфильтрованной ферментационной жидкости, десорбции минеральной кислотой, осаждением гентамицина из элюата органическим растворителем. Полученный сырец гентамицина многократно переосаждают. Получают сульфат гентамицина 80 - 85% степени чистоты с выходом 25% от содержания антибиотика в нативном растворе (Пат. США, N 3091572). По известному решению (а.с. CCCР N 528775) технический элюат очищают от примесей обработкой водородной формой сильносшитого сульфокатионита, нейтрализацией анионитом, обработкой углем и высушиванием элюата. Гентамицин сульфат, полученный по этому способу, содержит 15 - 20% минорных примесей.

Существуют способы очистки путем кристаллизации из этанола (а.с. СССР N 694034). Этот метод связан с использованием органических растворителей и не гарантирует получение гентамицина необходимого компонентного состава.

Наиболее эффективными способами очистки являются хроматографические методы. По патенту ФРГ N 2130113 гентамицин очищают пропусканием водного раствора сырца гентамицина через колонку с силикагелем или сульфат гентамицина 90% степени чистоты с выходом около 20%. Описан способ хроматографической очистки с использованием силикагеля и смеси растворителей хлороформ-метанол-аммиак (Пат. США N 3.651.042). По этому способу получают из сырца комплекса гентамицина отдельные основные компоненты C1a; C2; C1 90 - 95% степени чистоты.

Недостатками способа является длительность процесса, большой расход органических растворителей.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому положительному эффекту является способ выделения гентамицина по патенту ВНР N 167121 и может служить прототипом предлагаемого изобретения. По этому способу гентамицин комплекс сорбируют из отфильтрованной ферментационной жидкости натриевой формой карбоксильного катионита, помещенного в традиционную ионообменную колонну в течение не менее 24 - 30 часов, десорбируют 4 н. раствором серной кислоты. Элюат нейтрализуют триэтиламином и обрабатывают углем. Фильтрат осаждают десятикратным объемом метанола. Сырец гентамицина сульфата очищают путем его растворения в дистиллированной воде, повторной сорбции на специальном мелкозернистом катионите в аммониевой форме (Амберлит CG-50 тип II), десорбции раствором аммиака постепенно повышающейся в пределах 0,05 - 1,0 н. концентрации. Гентамицин комплекс выделяют из объединенных элюатов путем высушивания элюата досуха. Обработки высушенного порошка основания гентамицина смесью бензола и этанола (1:1) и сушки в вакууме над пятиокисью фосфора при 60oC. Полученный комплекс основания гентамицина растворяют в дистиллированной воде, раствор подкисляют до pH 4,5 серной кислотой (5 н.). Раствор обрабатывают углем. Фильтрат смешивают с десятикратным объемом метанола. Осадившуюся смесь выдерживают 24 часа при 0oC, затем отфильтровывают и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора. Получают гентамицин сульфат в выходом 35 - 40% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.

Основными недостатком прототипа являются многостадийность и длительность процесса - 24 стадии, 250 - 300 часов (см. схему), низкий выход целевого продукта (35 - 40%). Длительность процесса десорбции 4 н серной кислотой после первой сорбции (12 - 15 часов) приводит к повышенному загрязнению элюата с целевым веществом окрашивающими примесями и продуктами частичного разложения гентамицина, что приводит к необходимости дополнительной очистки перед второй сорбцией.

Недостатком является также следующее. Для выделения целевого продукта используют большое количество органических растворителей, в том числе особо ядовитого - метанола. Для сорбции гентамицина используют только отфильтрованную ферментационную жидкость. Процесс ее фильтрации трудоемок, требует специального оборудования, наполнителей, является экологически вредным. Сорбцию проводят в традиционных ионообменных колоннах в динамических условиях в системе последовательных колонн. В процессе сорбции создается высокое гидродинамическое сопротивление слоя сорбента движению ферментационной жидкости за счет постепенного уплотнения сорбента. Процесс замедляется до 24 - 36 часов, образуются местные каналы с преимущественным протеканием раствора, т. е. создаются неблагоприятные условия для массообмена между сорбентов и раствором. При увеличении скорости потока ферментационной жидкости через слой сорбента происходит значительный унос сорбента, а, следовательно, потеря сорбированного целевого продукта.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа выделения гентамицина и повышение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается путем контактирования сорбента с ферментационной жидкостью в течение не менее 4 часов в сорбционно-промывном аппарате, пропускания через катионит сначала 0,03 - 0,045 н. (предпочтительно 0,04 н.) раствора аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час, а затем 2 н. раствора аммиака за 4-5 часов.

Заявляемый способ заключается в следующем: в ферментационную жидкость добавляют щавелевую кислоту до pH 1,8 - 2,2, ПАВ-цетазол - для снижения вязкости и устранения слипания частиц сорбента (в случае использования отфильтрованной ферментационной жидкости цетазол не добавляют), нейтрализуют раствором щелочи до pH 6,2 - 6,8. В колонну с расширителем в верхней зоне, снабженную в узкой цилиндрической части насадками КРИМЗ, а также пульскамерой и аэрлифтом (см. чертеж), помещают катионит КБ-2 (или другой карбоксильный катионит) в Na или NH4-форме. Ферментационную жидкость контактируют с катионитом пропусканием жидкости снизу вверх в периодическом или непрерывном режиме не менее 4 часов. Катионитом сорбируется 95 - 98% гентамицина, содержащегося в фермертационной жидкости. По окончании сорбции катионит промывают умягченной водой, а затем в течение 16 - 18 часов через катионит пропускают сверху вниз 0,03 - 0,045 н. водный раствор аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час. Длительность промывки - 16 - 18 часов.

В процессе промывки катионита слабым раствором аммиака из катионита вытесняют минорные компоненты и окрашивающие примеси. Окончание промывки устанавливают по содержанию минорных компонентов и окрашивающих примесей в отдельных фракциях, отбираемых в процессе промывки. Для определения компонентов в комплексе гентамицина (основных и минорных) во фракциях во время промывки 0,03 - 0,045 н. аммиаком, а также при десорбции антибиотика 2 н раствором аммиака используют метод ТСХ.

Антибиотик десорбируют с катионита в течение 4-5 часов 2 н раствором аммиака. Полученный элюат упаривают, концентрат обрабатывают углем (для удаления остатков окрашивающих примесей), подкисляют серной кислотой до pH 4 - 4,5 и удаляют из него воду высушиванием досуха. Получают порошок гентамицина сульфата по качеству, удовлетворяющего требования НТД (ФС N 421267-82).

Содержание минорных компонентов в препарате не превышает 3 - 5%. Выход гентамицина составляет 52 - 60% от содержания его в ферментационной жидкости.

Существенное отличие описываемого способа заключается в том, что сорбцию антибиотика проводят как из нефильтрованной ферментационной жидкости, так и после ее фильтрации (предпочтительнее из нефильтрованной). Ферментационную жидкость контактируют с сорбентом в сорбционно-промывном аппарате в течение не менее 4 часов, после чего сорбент промывают сначала 0,03 - 0,045 н. раствором аммиака, который пропускают со скоростью 6 - 10 мл/г-час, а затем 2 н. раствором аммиака 4-5 часов.

Описываемый способ позволяет упростить процесс: вместо 24 стадий по прототипу в заявляемом способе весь процесс состоит из 9 стадий (см. Приложение), что позволяет сократить в 4-5 раз общее время процесса (за счет сокращения времени сорбции, устранения второй сорбции из элюата, сокращения времени промывки). По прототипу весь процесс выделения и получения порошка сульфата гентамицина протекает в течение 250 - 300 часов. По предлагаемому способу - 50 часов. Сокращение времени процесса выделения препарата в несколько раз увеличивает соответственно во столько же раз производительность процесса. Кроме того, использование сорбционно-промывного аппарат для сорбции гентамицина позволяет исключить стадию предварительного отделения биомассы и проводить сорбцию непосредственно из нефильтрованной ферментационной жидкости, что значительно сокращает потери продукта.

Описываемый способ позволяет повысить выход целевого вещества на 17 - 20% по сравнению с прототипом (по прототипу 35 - 40% от ферментационной жидкости, а по предлагаемому способу - 52 - 60%).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
В 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл вносят 220 мл 20%-го раствора цетазола, смесь перемешивают 10 мин, затем в нее вносят 3,65 л насыщенного раствора щавелевой кислоты (pH 1,8 - 2,2). Массу перемешивают 20 - 30 мин, затем ее нейтрализуют 30%-ным раствором едкого натра до pH 6,2 - 6,8. Общий объем смеси - 44 л.

Сорбцию из нефильтрованной ферментационной жидкости проводят в сорбционно-промывном аппарате (см. чертеж), состоящим из узкой цилиндрической насадочной части аппарата и расширителя. Аппарат снабжен пульскамерой и аэрлифтом. Объем цилиндрической части колонны - 10 л; диаметр - 10 см. Объем расширителя - 35 л; диаметр - 30 см; общий объем аппарата - 50 л. В аппарат загружают 1 л карбоксильного катионита КБ-2 в NH4-форме. При включенной пульскамере (интенсивность пульсации - 600 мм/мин) в аппарат подается весь объем ферментационной жидкости. После этого включают аэрлифт (замкнутый на колонну) и проводят сорбцию в режиме рециркуляции. Время сорбции - 4 часа. При этом катионитом сорбируется 98% гентамицина, содержащегося в фрментационной жидкости.

После сорбции катионит отмывают от остатков мицелия умягченной водой, для чего при работающем пульсаторе (интенсивность пульсации не менее 400 мм/мин подают воду подачей снизу вверх. Затем через катионит пропускают сверху вниз 20,2 л 0,04 н. раствор аммиака со скоростью 8 мл/г-час. Длительность промывки - 16 часов. При промывке катионита слабым раствором аммиак отбирают фракции элюатов по 2 л каждую (из расчета двукратного объема сорбента), в которых определяют компонентный состав (методом ТСХ - в системе хлорформ-метанол - 25%-ный раствор аммиака в соотношении 2:1:1, проявление в парах иода). Контролем вымывания является отсутствие минорных примесей в последних фракциях промывок. После вымывания минорных и окрашивающих примесей из катионита через него пропускают в течение 4-5 часов 2,0 н. раствор аммиака. Собирают элюаты фракций, имеющие активность не менее 1000 мкг/мл и содержащие только основные компоненты гентамицина, которые объединяют. Элюат выпаривают в вакууме до концентрации антибиотика, равной 180000 мкг/мл (в 5-6 раз от первоначального объема элюата). Получают 117,7 мл концентрата, который подкисляют серной кислотой до pH 4,5, смешивают с 8 г осветляющего угля, суспензию отфильтровывают, угол промывают 50 мл дистиллированной воды. Промывку присоединяют к основному осветленному раствору. Практически бесцветный раствор гентамицина высушивают на роторном испарителе. Получают 31,8 г белого порошка сульфата гентамицина с активностью 600 мкг/мг и содержанием влаги 5%. Активность порошка в пересчете на сухое вещество - 631 мкг/мг (98,5% степени чистоты). Содержание основных компонентов в субстанции (порошке) комплекса гентамицина:
C1a - 26%; C2 - 38,5%; C1 - 34%; содержание минорных примесей - 1,5% (компонентный состав определен методами ТСХ и ВЭЖХ). Остальные показатели качества субстанции сульфата гентамицина удовлетворяют требованиям ФС N 42-1267-82. Выход гентамицина сульфата составляет 59,6% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.

Пример 2
В 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл вносят при перемешивании 535 г щавелевой кислоты до pH 1,8, затем в ферментационную жидкость вносят 117,6 г триполифосфата натрия. После выдержки без перемешивания ферментационную жидкость фильтруют на фильтр-прессе, на который перед фильтрацией наносят в виде суспензии фильтрующий наполнитель - перлит. Длительность фильтрации - 10 часов. Затем отфильтрованный мицелий промывают на фильтр-прессе умягченной водой и промывную воду присоединяют к отфильтрованной ферментационной жидкости.

Затем фильтрат нейтрализуют 30%-ным раствором едкого натра до pH 6,5 (6,2 - 6,8). Получают 36,7 л нативного раствора с активностью 610 мкг/мл. Потери на стадии фильтрации составляют 30%. Сорбцию гентамицина проводят в сорбционно-промывном аппарате, в который загружают 560 мл катионита КБ-2 в NH4-форме. Сорбция, отмывка умягченной водой от остатков нативного раствора, промывка слабым раствором аммиака, десорбция, упарка, осветление и выделение порошка гентамицина проводятся в условиях, приведенных в примере 1. Получают 27,8 г сульфата гентамицина с активностью 595 мкг/мг и содержание влаги 6,3%. Активность порошка в пересчете на сухое вещество 635 мкг/мг (99% степени чистоты).

Содержание основных компонентов в субстанции (порошке) комплекса гентамицина: C1a - 25,0%; C2 - 39,5%; C1 - 34,5%: содержание минорных примесей - 1%. Остальные показатели качества субстанции сульфата гентамицина удовлетворяют требованиям ФС N 42-1267-82.

Выход гентамицина сульфата составляет 51,7% от содержания гентамицина в ферментационной жидкости.

Пример 3
Отличающийся от примера 1 тем, что сорбцию ведут в динамическом режиме, подавая непрерывно снизу колонны предварительно подготовленную для извлечения ферментационную жидкость с выходом отработанной ферментационной жидкости через верхний выход в расширителе на слив.

С этой целью 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл обрабатывают как описано в примере 1 и разводят обессоленной водой до общего объема 80 л. В сорбционно-промывной аппарат, описанный в примере 1, загружают 500 мл набухшего карбоксильного катионита КБ-2 в NH4-форме. Включают пульсацию (интенсивность пульсации 600 мм/мин) и в течение 7 часов пропускают 80 л обработанной и разбавленной как указано выше вдвое ферментационной жидкости гентамицина. При этом катионитом сорбируется 98% антибиотика при насыщении 62,7 мг/мл.

Отмывка остатков мицелия умягченной водой, промывка катионита от сопутствующих примесей, десорбция и выделение субстанции гентамицина сульфата проводится как в примере 1.

Получают 32,0 г порошка сульфата гентамицина с активностью 602 мкг/мг и удовлетворяющего требованиям ФС N 42-1267-82. Содержание минорных примесей - 1,6%.

Содержание основных компонентов C1a - 26,5%; C2 - 38,0%; C1 - 33,9%. Выход гентамицина сульфата составляет 60,2% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.

Похожие патенты RU2119495C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ 1994
  • Булычева Маргарита Степановна
  • Яхонтова Любовь Федоровна
  • Синицын Михаил Азарьевич
  • Жданович Юрий Васильевич
  • Яроцкий Сергей Викторович
  • Любимов Владимир Константинович
  • Рагинский Леонид Соломонович
  • Кузнецов Юрий Викторович
  • Саловой Николай Васильевич
  • Михайлов Виктор Александрович
RU2117699C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ 1992
  • Булычева М.С.
  • Яхонтова Л.Ф.
  • Синицын М.А.
  • Жданович Ю.В.
  • Навашин С.М.
  • Туговиков Н.В.
  • Логинова Л.И.
  • Березовская А.И.
  • Кобзиева С.Н.
  • Насонова Л.И.
RU2074257C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ СУБСТАНЦИИ ТОБРАМИЦИНА ОСНОВАНИЯ 2000
  • Ноговицына Людмила Васильевна
  • Михайлов Виктор Александрович
  • Харечко Анатолий Трофимович
  • Садовой Николай Васильевич
RU2280648C2
Штамм Amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика 2016
  • Лапчинская Ольда Анастасьевна
  • Катруха Генрих Степанович
  • Погожева Валерия Владимировна
  • Пономаренко Валерий Иванович
  • Филичева Валентина Андреевна
  • Харитонова Лидия Александровна
  • Лапчинская Мария Юльевна
  • Яковенко Алла Николаевна
  • Нифантьев Николай Эдуардович
  • Шашков Александр Степанович
  • Цветков Дмитрий Евгеньевич
RU2633511C1
СПОСОБ СОРБЦИОННОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТАЛЛИЯ ОТ ПРИМЕСЕЙ 2003
  • Поляков Л.А.
  • Татаринов А.Н.
  • Коноплина Л.Я.
  • Монастырев Ю.А.
  • Ребрин О.И.
  • Смирнов А.Л.
  • Рычков В.Н.
  • Мочалов А.П.
RU2251583C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ 1994
  • Устюжанина И.Ю.
  • Чумакова Л.К.
  • Каминская М.И.
  • Богданов А.П.
  • Воротникова М.В.
  • Клюева Л.М.
RU2079555C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ТИЛОЗИНА 1997
  • Есипов С.Е.
  • Даниленко В.Н.
  • Воронкова В.В.
RU2114173C1
ШТАММ AMYCOLATOPSIS ORIENTALIS SUBSP. EREMOMYCINI ВКПМ-S892 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРЕМОМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА ЭРЕМОМИЦИНА 1997
  • Бражникова М.Г.
  • Лайко А.В.
  • Федорова Г.Б.
  • Преображенская Т.П.
  • Свешникова М.А.
  • Лапчинская О.А.
  • Сабурова Т.П.
  • Погожева В.В.
  • Ломакина Н.Н.
  • Бердникова Т.Ф.
  • Катруха Г.С.
  • Толстых И.В.
  • Голова Т.П.
  • Архангельская Н.М.
  • Гладких Е.Г.
  • Макарова М.О.
  • Шаповалова С.П.
  • Шепелевцева Н.Г.
  • Филиппосьянц С.Т.
RU2110578C1
Способ выделения -триптофана 1977
  • Шолин Альберт Федорович
  • Рошаль Евгений Рэмович
SU749889A1
Способ получения оксида скандия 2015
  • Гедгагов Эдуард Измайлович
  • Тарасов Андрей Владимирович
  • Королева Тамара Андреевна
  • Махов Сергей Владимирович
RU2608033C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 119 495 C1

Реферат патента 1998 года СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКА ГЕНТАМИЦИНА

Способ позволяет усовершенствовать выделение и очистку антибиотика гентамицина. Для этого сорбент контактируют с ферментационной жидкостью в течение не менее 4 ч в сорбционно-промывном аппарате, после чего через катионит пропускают сначала 0,03 - 0,045 н. раствор аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г • ч, затем 2 н. раствор аммиака за 4 - 5 ч. 1 ил.

Формула изобретения RU 2 119 495 C1

Способ выделения антибиотика гентамицина, включающий обработку ферментационной жидкости, сорбцию карбоксильным катионитом, вымывание примесей из катионита, десорбцию и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что сорбент контактируют с ферментационной жидкостью в течение не менее 4-х часов в сорбционно-промывном аппарате, после чего через катионит пропускают сначала 0,03 - 0,045 н раствор аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час, затем 2 н раствор аммиака за 4-5 ч.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1998 года RU2119495C1

МЕХАНИЗИРОВАННЫЙ КОПЕР ДЛЯ РАЗБИВКИ МЕТАЛЛОЛОМА 0
SU167121A1

RU 2 119 495 C1

Авторы

Яроцкий Сергей Викторович

Яхонтова Любовь Федоровна

Булычева Маргарита Степановна

Жданович Юрий Васильевич

Кобзиева Серафима Николаевна

Насонова Лидия Ивановна

Садовой Николай Васильевич

Михайлов Виктор Александрович

Шерстобитова Татьяна Сергеевна

Кузьмина Людмила Михайловна

Даты

1998-09-27Публикация

1994-10-10Подача