СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКА ГЕНТАМИЦИНА Российский патент 1998 года по МПК C07H15/234 

Изобретение относится к области медицинской промышленности, конкретно касается усовершенствования способа выделения антибиотика гентамицина.

Гентамицин представляет собой смесь (гентамицин C-комплекс), состоящую из трех основных компонентов C_1a; C₂; C₁, содержание которых в комплексе строго нормировано (согласно кодекса Федеральных правил США FDA-78 содержание C_1a - 15 - 40%; C₂ - 20 - 50%; C₁ - 25 - 50%).

В процессе биосинтеза гентамицина в ферментационной жидкости наряду с его основными компонентами продуцируются сходные с ним родственные примеси - минорные компоненты, которые сопутствуют целевому продукту при его извлечении из этой ферментационной жидкости. Содержание минорных компонентов в готовом препарате гентамицина в зависимости от способов очистки достигает 5 - 30%.

Удаление этих примесей из комплекса гентамицина необходимо вследствие возможных нежелательных свойств этих примесей и их низкой биологической активности. Кроме того, присутствие в препаратах гентамицина минорных компонентов не позволяет получить целевое вещество со стандартными качественными характеристиками. Отделению этих примесей от основного комплекса гентамицина, связанному с большими трудностями, посвящен ряд исследований.

Известны способы очистки комплекса гентамицина путем сорбции из нативного раствора - отфильтрованной ферментационной жидкости, десорбции минеральной кислотой, осаждением гентамицина из элюата органическим растворителем. Полученный сырец гентамицина многократно переосаждают. Получают сульфат гентамицина 80 - 85% степени чистоты с выходом 25% от содержания антибиотика в нативном растворе (Пат. США, N 3091572). По известному решению (а.с. CCCР N 528775) технический элюат очищают от примесей обработкой водородной формой сильносшитого сульфокатионита, нейтрализацией анионитом, обработкой углем и высушиванием элюата. Гентамицин сульфат, полученный по этому способу, содержит 15 - 20% минорных примесей.

Существуют способы очистки путем кристаллизации из этанола (а.с. СССР N 694034). Этот метод связан с использованием органических растворителей и не гарантирует получение гентамицина необходимого компонентного состава.

Наиболее эффективными способами очистки являются хроматографические методы. По патенту ФРГ N 2130113 гентамицин очищают пропусканием водного раствора сырца гентамицина через колонку с силикагелем или сульфат гентамицина 90% степени чистоты с выходом около 20%. Описан способ хроматографической очистки с использованием силикагеля и смеси растворителей хлороформ-метанол-аммиак (Пат. США N 3.651.042). По этому способу получают из сырца комплекса гентамицина отдельные основные компоненты C_1a; C₂; C₁ 90 - 95% степени чистоты.

Недостатками способа является длительность процесса, большой расход органических растворителей.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому положительному эффекту является способ выделения гентамицина по патенту ВНР N 167121 и может служить прототипом предлагаемого изобретения. По этому способу гентамицин комплекс сорбируют из отфильтрованной ферментационной жидкости натриевой формой карбоксильного катионита, помещенного в традиционную ионообменную колонну в течение не менее 24 - 30 часов, десорбируют 4 н. раствором серной кислоты. Элюат нейтрализуют триэтиламином и обрабатывают углем. Фильтрат осаждают десятикратным объемом метанола. Сырец гентамицина сульфата очищают путем его растворения в дистиллированной воде, повторной сорбции на специальном мелкозернистом катионите в аммониевой форме (Амберлит CG-50 тип II), десорбции раствором аммиака постепенно повышающейся в пределах 0,05 - 1,0 н. концентрации. Гентамицин комплекс выделяют из объединенных элюатов путем высушивания элюата досуха. Обработки высушенного порошка основания гентамицина смесью бензола и этанола (1:1) и сушки в вакууме над пятиокисью фосфора при 60^oC. Полученный комплекс основания гентамицина растворяют в дистиллированной воде, раствор подкисляют до pH 4,5 серной кислотой (5 н.). Раствор обрабатывают углем. Фильтрат смешивают с десятикратным объемом метанола. Осадившуюся смесь выдерживают 24 часа при 0^oC, затем отфильтровывают и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора. Получают гентамицин сульфат в выходом 35 - 40% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.

Основными недостатком прототипа являются многостадийность и длительность процесса - 24 стадии, 250 - 300 часов (см. схему), низкий выход целевого продукта (35 - 40%). Длительность процесса десорбции 4 н серной кислотой после первой сорбции (12 - 15 часов) приводит к повышенному загрязнению элюата с целевым веществом окрашивающими примесями и продуктами частичного разложения гентамицина, что приводит к необходимости дополнительной очистки перед второй сорбцией.

Недостатком является также следующее. Для выделения целевого продукта используют большое количество органических растворителей, в том числе особо ядовитого - метанола. Для сорбции гентамицина используют только отфильтрованную ферментационную жидкость. Процесс ее фильтрации трудоемок, требует специального оборудования, наполнителей, является экологически вредным. Сорбцию проводят в традиционных ионообменных колоннах в динамических условиях в системе последовательных колонн. В процессе сорбции создается высокое гидродинамическое сопротивление слоя сорбента движению ферментационной жидкости за счет постепенного уплотнения сорбента. Процесс замедляется до 24 - 36 часов, образуются местные каналы с преимущественным протеканием раствора, т. е. создаются неблагоприятные условия для массообмена между сорбентов и раствором. При увеличении скорости потока ферментационной жидкости через слой сорбента происходит значительный унос сорбента, а, следовательно, потеря сорбированного целевого продукта.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа выделения гентамицина и повышение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается путем контактирования сорбента с ферментационной жидкостью в течение не менее 4 часов в сорбционно-промывном аппарате, пропускания через катионит сначала 0,03 - 0,045 н. (предпочтительно 0,04 н.) раствора аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час, а затем 2 н. раствора аммиака за 4-5 часов.

Заявляемый способ заключается в следующем: в ферментационную жидкость добавляют щавелевую кислоту до pH 1,8 - 2,2, ПАВ-цетазол - для снижения вязкости и устранения слипания частиц сорбента (в случае использования отфильтрованной ферментационной жидкости цетазол не добавляют), нейтрализуют раствором щелочи до pH 6,2 - 6,8. В колонну с расширителем в верхней зоне, снабженную в узкой цилиндрической части насадками КРИМЗ, а также пульскамерой и аэрлифтом (см. чертеж), помещают катионит КБ-2 (или другой карбоксильный катионит) в Na или NH₄-форме. Ферментационную жидкость контактируют с катионитом пропусканием жидкости снизу вверх в периодическом или непрерывном режиме не менее 4 часов. Катионитом сорбируется 95 - 98% гентамицина, содержащегося в фермертационной жидкости. По окончании сорбции катионит промывают умягченной водой, а затем в течение 16 - 18 часов через катионит пропускают сверху вниз 0,03 - 0,045 н. водный раствор аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час. Длительность промывки - 16 - 18 часов.

В процессе промывки катионита слабым раствором аммиака из катионита вытесняют минорные компоненты и окрашивающие примеси. Окончание промывки устанавливают по содержанию минорных компонентов и окрашивающих примесей в отдельных фракциях, отбираемых в процессе промывки. Для определения компонентов в комплексе гентамицина (основных и минорных) во фракциях во время промывки 0,03 - 0,045 н. аммиаком, а также при десорбции антибиотика 2 н раствором аммиака используют метод ТСХ.

Антибиотик десорбируют с катионита в течение 4-5 часов 2 н раствором аммиака. Полученный элюат упаривают, концентрат обрабатывают углем (для удаления остатков окрашивающих примесей), подкисляют серной кислотой до pH 4 - 4,5 и удаляют из него воду высушиванием досуха. Получают порошок гентамицина сульфата по качеству, удовлетворяющего требования НТД (ФС N 421267-82).

Содержание минорных компонентов в препарате не превышает 3 - 5%. Выход гентамицина составляет 52 - 60% от содержания его в ферментационной жидкости.

Существенное отличие описываемого способа заключается в том, что сорбцию антибиотика проводят как из нефильтрованной ферментационной жидкости, так и после ее фильтрации (предпочтительнее из нефильтрованной). Ферментационную жидкость контактируют с сорбентом в сорбционно-промывном аппарате в течение не менее 4 часов, после чего сорбент промывают сначала 0,03 - 0,045 н. раствором аммиака, который пропускают со скоростью 6 - 10 мл/г-час, а затем 2 н. раствором аммиака 4-5 часов.

Описываемый способ позволяет упростить процесс: вместо 24 стадий по прототипу в заявляемом способе весь процесс состоит из 9 стадий (см. Приложение), что позволяет сократить в 4-5 раз общее время процесса (за счет сокращения времени сорбции, устранения второй сорбции из элюата, сокращения времени промывки). По прототипу весь процесс выделения и получения порошка сульфата гентамицина протекает в течение 250 - 300 часов. По предлагаемому способу - 50 часов. Сокращение времени процесса выделения препарата в несколько раз увеличивает соответственно во столько же раз производительность процесса. Кроме того, использование сорбционно-промывного аппарат для сорбции гентамицина позволяет исключить стадию предварительного отделения биомассы и проводить сорбцию непосредственно из нефильтрованной ферментационной жидкости, что значительно сокращает потери продукта.

Описываемый способ позволяет повысить выход целевого вещества на 17 - 20% по сравнению с прототипом (по прототипу 35 - 40% от ферментационной жидкости, а по предлагаемому способу - 52 - 60%).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
В 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл вносят 220 мл 20%-го раствора цетазола, смесь перемешивают 10 мин, затем в нее вносят 3,65 л насыщенного раствора щавелевой кислоты (pH 1,8 - 2,2). Массу перемешивают 20 - 30 мин, затем ее нейтрализуют 30%-ным раствором едкого натра до pH 6,2 - 6,8. Общий объем смеси - 44 л.

Сорбцию из нефильтрованной ферментационной жидкости проводят в сорбционно-промывном аппарате (см. чертеж), состоящим из узкой цилиндрической насадочной части аппарата и расширителя. Аппарат снабжен пульскамерой и аэрлифтом. Объем цилиндрической части колонны - 10 л; диаметр - 10 см. Объем расширителя - 35 л; диаметр - 30 см; общий объем аппарата - 50 л. В аппарат загружают 1 л карбоксильного катионита КБ-2 в NH₄-форме. При включенной пульскамере (интенсивность пульсации - 600 мм/мин) в аппарат подается весь объем ферментационной жидкости. После этого включают аэрлифт (замкнутый на колонну) и проводят сорбцию в режиме рециркуляции. Время сорбции - 4 часа. При этом катионитом сорбируется 98% гентамицина, содержащегося в фрментационной жидкости.

После сорбции катионит отмывают от остатков мицелия умягченной водой, для чего при работающем пульсаторе (интенсивность пульсации не менее 400 мм/мин подают воду подачей снизу вверх. Затем через катионит пропускают сверху вниз 20,2 л 0,04 н. раствор аммиака со скоростью 8 мл/г-час. Длительность промывки - 16 часов. При промывке катионита слабым раствором аммиак отбирают фракции элюатов по 2 л каждую (из расчета двукратного объема сорбента), в которых определяют компонентный состав (методом ТСХ - в системе хлорформ-метанол - 25%-ный раствор аммиака в соотношении 2:1:1, проявление в парах иода). Контролем вымывания является отсутствие минорных примесей в последних фракциях промывок. После вымывания минорных и окрашивающих примесей из катионита через него пропускают в течение 4-5 часов 2,0 н. раствор аммиака. Собирают элюаты фракций, имеющие активность не менее 1000 мкг/мл и содержащие только основные компоненты гентамицина, которые объединяют. Элюат выпаривают в вакууме до концентрации антибиотика, равной 180000 мкг/мл (в 5-6 раз от первоначального объема элюата). Получают 117,7 мл концентрата, который подкисляют серной кислотой до pH 4,5, смешивают с 8 г осветляющего угля, суспензию отфильтровывают, угол промывают 50 мл дистиллированной воды. Промывку присоединяют к основному осветленному раствору. Практически бесцветный раствор гентамицина высушивают на роторном испарителе. Получают 31,8 г белого порошка сульфата гентамицина с активностью 600 мкг/мг и содержанием влаги 5%. Активность порошка в пересчете на сухое вещество - 631 мкг/мг (98,5% степени чистоты). Содержание основных компонентов в субстанции (порошке) комплекса гентамицина:
C_1a - 26%; C₂ - 38,5%; C₁ - 34%; содержание минорных примесей - 1,5% (компонентный состав определен методами ТСХ и ВЭЖХ). Остальные показатели качества субстанции сульфата гентамицина удовлетворяют требованиям ФС N 42-1267-82. Выход гентамицина сульфата составляет 59,6% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.

Пример 2
В 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл вносят при перемешивании 535 г щавелевой кислоты до pH 1,8, затем в ферментационную жидкость вносят 117,6 г триполифосфата натрия. После выдержки без перемешивания ферментационную жидкость фильтруют на фильтр-прессе, на который перед фильтрацией наносят в виде суспензии фильтрующий наполнитель - перлит. Длительность фильтрации - 10 часов. Затем отфильтрованный мицелий промывают на фильтр-прессе умягченной водой и промывную воду присоединяют к отфильтрованной ферментационной жидкости.

Затем фильтрат нейтрализуют 30%-ным раствором едкого натра до pH 6,5 (6,2 - 6,8). Получают 36,7 л нативного раствора с активностью 610 мкг/мл. Потери на стадии фильтрации составляют 30%. Сорбцию гентамицина проводят в сорбционно-промывном аппарате, в который загружают 560 мл катионита КБ-2 в NH₄-форме. Сорбция, отмывка умягченной водой от остатков нативного раствора, промывка слабым раствором аммиака, десорбция, упарка, осветление и выделение порошка гентамицина проводятся в условиях, приведенных в примере 1. Получают 27,8 г сульфата гентамицина с активностью 595 мкг/мг и содержание влаги 6,3%. Активность порошка в пересчете на сухое вещество 635 мкг/мг (99% степени чистоты).

Содержание основных компонентов в субстанции (порошке) комплекса гентамицина: C_1a - 25,0%; C₂ - 39,5%; C₁ - 34,5%: содержание минорных примесей - 1%. Остальные показатели качества субстанции сульфата гентамицина удовлетворяют требованиям ФС N 42-1267-82.

Выход гентамицина сульфата составляет 51,7% от содержания гентамицина в ферментационной жидкости.

Пример 3
Отличающийся от примера 1 тем, что сорбцию ведут в динамическом режиме, подавая непрерывно снизу колонны предварительно подготовленную для извлечения ферментационную жидкость с выходом отработанной ферментационной жидкости через верхний выход в расширителе на слив.

С этой целью 40 л ферментационной жидкости гентамицина с активностью 800 мкг/мл обрабатывают как описано в примере 1 и разводят обессоленной водой до общего объема 80 л. В сорбционно-промывной аппарат, описанный в примере 1, загружают 500 мл набухшего карбоксильного катионита КБ-2 в NH₄-форме. Включают пульсацию (интенсивность пульсации 600 мм/мин) и в течение 7 часов пропускают 80 л обработанной и разбавленной как указано выше вдвое ферментационной жидкости гентамицина. При этом катионитом сорбируется 98% антибиотика при насыщении 62,7 мг/мл.

Отмывка остатков мицелия умягченной водой, промывка катионита от сопутствующих примесей, десорбция и выделение субстанции гентамицина сульфата проводится как в примере 1.

Получают 32,0 г порошка сульфата гентамицина с активностью 602 мкг/мг и удовлетворяющего требованиям ФС N 42-1267-82. Содержание минорных примесей - 1,6%.

Содержание основных компонентов C_1a - 26,5%; C₂ - 38,0%; C₁ - 33,9%. Выход гентамицина сульфата составляет 60,2% от содержания антибиотика в ферментационной жидкости.

Способ позволяет усовершенствовать выделение и очистку антибиотика гентамицина. Для этого сорбент контактируют с ферментационной жидкостью в течение не менее 4 ч в сорбционно-промывном аппарате, после чего через катионит пропускают сначала 0,03 - 0,045 н. раствор аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г • ч, затем 2 н. раствор аммиака за 4 - 5 ч. 1 ил.

Способ выделения антибиотика гентамицина, включающий обработку ферментационной жидкости, сорбцию карбоксильным катионитом, вымывание примесей из катионита, десорбцию и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что сорбент контактируют с ферментационной жидкостью в течение не менее 4-х часов в сорбционно-промывном аппарате, после чего через катионит пропускают сначала 0,03 - 0,045 н раствор аммиака со скоростью 6 - 10 мл/г-час, затем 2 н раствор аммиака за 4-5 ч.