СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и патологической анатомии.

Известен способ дифференциальной диагностики гиперпластических процессов и рака молочной железы в гистологических срезах окрашенных наиболее популярным в гистологической практике методом окраски - гематоксилином и зозином. Способ основан на микроскопическом выявлении в концевых отделах долек, внутридольковых и внедольковых протоках пролифератов клеток. К дифференциально-диагностическим критериям в одних случаях относятся мономерфизм, в других - полиморфизм клеток и гиперхромию ядер, нарушение полярности расположения клеток и увеличение их митотической активности (Ермилова В.Д. Опухоли молочной железы. Руководство по патологоанатомической диагностике опухолей человека. /Под ред. Н.А.Краевского, А.В.Смольянникова, Д.С.Саркисова. - З-е изд. -М.: Медицина, 1982, c. 210-232). При достаточно высокой степени дифференсировки опухоли неинфильтрующие раки молочной железы представляют значительные трудности для дифференциальной диагностики с предраковыми гиперпластическими процессами, а также доброкачественными опухолями. Наиболее достоверным признаком является инвазивный рост (Головин Д.И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей: руководство для врачей. -Л.: Медицина, 1982., c 304 ), что знаменует собой уже диссеминированную форму заболевания. В связи с этим приходится прибегать к исследованию многочисленных срезов материала и консультативной помощи. В отдельных случаях все эти приемы не позволяют утвердительно ответить на вопрос о наличии или отсутствии рака, особенно при исследовании материала срочных биопсий.

Известен способ, выбранный в качестве прототипа, диагностики рака в гистологических срезах, основанный на иммунологическом выявлении индивидуальных веществ в клетках, являющийся в настоящее время одним из современных и быстро развивающихся методов уточняющей гисто- и цитологической диагностики (Франк Г.А., Пугачев К.К., Шабалова И.П., Шимбирева И.Б.//Арх.пат. 1990. т. 52, N. 8, с. 70-74). В настоящее время известно значительное число разнообразных типов биологических веществ, которые относят к опухолевым маркерам: онкофетальные антигены, изоэнзимы, продукты онкогенов, специфические для той или другой клетки белки, т.е. маркеры клеток; муцимы и другие гликопротеины; тормоны и прочие соединения (Романенко А.М.//Арх.пат. 1989, т.51, N 4, с. 58-62; Bobrow L. A. , Nartou A.J. //Cancer Surv. - 1987. Vol.6, N 2. - p. 209-225; Virji M.A., Mercer D.W., Herberman R.B. //CA. - 1988. - Vol.38, N 2.-p. 104-126.).

Несмотря на обилие исследований, в которых описываются и применяются опухолевые маркеры, последние не позволяют отличить доброкачественные клетки от злокачественных (Donat E.E. //Canad. S. wed. Technob- 1987. -Vol. 49, N3. -P. 173-176; Wick M. R. // Arch, Patn. Lab. Med. -1986.-Vol.110, N 3.-p. 180-181).

Задача предлагаемого способа заключается в проведении иммуногистохимической реакции, позволяющей с помощью разной строго специфической окраски показать различия интактного, гиперплазированного и атипичного эпителия ацинусов долек, внутридольковых и внедольковых протоков.

Поставленная задача достигается тем, что в способе, основанном на проведении иммунопероксидазной реакции, используют первичные антитела против одного из белков семейства макроглобулинов ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина (АБГ), являющегося ингибитором протеиназ. Следует подчеркнуть, что АБГ не является специфической принадлежностью эпителия молочной железы. Этот белок принимает участие в рестрикции активности протеиназ различной локализации. Биосинтез его осуществляется в основном лимфоцитами (преимущественно B-лимфоцитами) и моноцитами. Таким образом, нормальные структуры молочной железы АБГ не содержат.

Известно, что злокачественный рост сопровождается увеличением активности лизосомальных протеинов (Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.М. Протеолиз в норме и при патологии. Киев: Здоровья, 1988, c.200 ).

Одновременно с этим образованием комплексов белки семейства макроглобулинов - ферменты вводят в действие мощный иммуносупрессивный потенциал, который и защищает злокачественное новообразование от атак иммунокомпетентных клеток. Следовательно, рост опухоли увеличивает ее защитный потенциал. Концентрация рестрикторов протеиназ хорошо корректирует с массой злокачественной опухоли, что связывают с локальным биосинтезом макроглобулинов опухолевыми клетками (Зорин Н.А., Зорина Р.М. Горин В.С.//Акушерство и гинекология. 1986. N 6, с. 6-9).

Эпителиальные образования, подвергшиеся гиперплазии, находятся в промежуточном положении и в отличие от нормальных клеток содержат АБГ, но в значительно меньшем количестве, чем злокачественные клетки. Таким образом, иммуногистохимическая детекция АБГ отразит количественные отличия содержания данного белка в эпителиальных структурах, находящихся в разных состояниях, соответствующих норме, гиперплазии и озлокачествлению.

Сущность предлагаемого способа иммуногистохимической детекции АБГ в гистологических срезах молочной железы, ее пролифератов и рака заключаются в следующем. Проводимая реакция включает ряд этапов.

1. Регидратация срезов и удаление из них остатков парафина. Для этого срезы проводят через три порции о-ксилола, абсолютный этанол, спирт 70 и 56%-ный, а также забуференный физиологический раствор (ЗФР) - по три минуты в каждой порции жидкости.

2. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют путем внесения на срез нескольких капель 3%-ный перекиси водорода на 10 мин.

3. Блокирование неспецифической сорбции иммуноглобулинов достигают путем нанесения на срез лошадиной сыворотки в разведении 1:20 на 30 мин.

4. Этап обработки гистологических срезов первичными антителами в концентрации 8-10 мкг/мл, разведенными в ЗФР с добавлением 3%-ного альбумина и 0,01%-ного азида натрия. Инкубация срезов осуществляется в течение 30 мин при 37^oC.

5. Инкубация гистологчиеских срезов вторичными антителами в разведении 10 мкг/мл ЗФР на 30 мин.

6. Обработка срезов комплексом авидин-пероксидаза в концентрации 25 мкг/мл в течение 30 мин.

7. Проявление пероксидазной активности 3,3-диаминобензидином тетрахлоридом (ДАБ) и ЗФР в соотношении 500 мкг ДАБ на 1 мл ЗФР. К свежеприготовленному раствору прибавляют 0,03%-ную перекись водорода и срезы инкубируют с субстратом в течение 10 мин. Реакцию останавливают погружением срезов в дистиллированную воду. В дальнейшем срезы проводят по спиртам восходящей концентрации и трем порциям о-ксилола, заключают в бальзам.

При проведении иммуногистохимической реакции используют "положительный контроль", т. е. срезы аналогичной исследуемой ткани с заведомо позитивной реакцией. В каждом случае применяют и "отрицательный контроль"; т.е. срезы аналогичной исследуемой ткани, в которых при проведении иммунопероксидазной реакции опущены 4 или 5 этапы ее с целью обнаружения возможного фонового окрашивания. Другими словами, применяют тест на качество забивки эндогенной пероксидазы.

В результате реакции получают отчетливую яркую окраску цитоплазмы клеток злокачественного новообразования, достигающей коричневого цвета. Эпителиальные структуры нормальной железы при этом не окрашиваются. Паренхиматозные образования участков гиперплазии имеют неравномерную окраску золотисто-желтого цвета.

Предлагаемый способ позволяет одномоментно распознавать в гистологическом срезе эпителиальные клетки нормальной ткани, участков гиперплазии и рака. Это позволяет повысить точность диагностики как отдельных из этих состояний органа, так и осуществлять дифференциальную диагностику их между собой.

Пример 1. Иммуногистохимическая детекция АБГ в ткани молочной железы с наличием очагов правильной типичной пролиферации эпителия протоков и долек.

Фрагменты операционного материала фиксируют 15%-ным водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающейся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 мин, две порции 70% и 80%-ного этанола по 6 ч в каждой, три порции 96%-ного этанола по 6 ч в каждой, абсолютный спирт 30 мин, абсолютный спирт - ксилол в равных соотношениях в течение 2 ч, ксилолпарафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 ч, три порции парафина при температуре 58^oC по одному часу в каждой. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе и наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5-8 мкм готовят с помощью микротома.

Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 мин в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при 37^oC в течение трех часов. Обезвоживание гистологических срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола (абсолютный, 96, 70 и 56%-ный) по три минуты в каждой. Далее срезы переводят на 5 мин в 0,05 М раствор ЗФР pH 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы (этот и последующие этапы реакции проводят в чашках Петри) осуществляют свежим 3%-ным раствором перекиси водорода. Длительность этапа 10 мин ЗФР 5 мин.

Далее срезы выдерживают под каплей 5%-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина (50 мг альбумина в 1 мл ЗФР). После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг среза. На последний наносят каплю аффинно-очищенных кроличьих антител против АБГ в концентрации 8 мкг/мл ЗФР. Раствор антител включает в себе 3% альбумина и 0,01% азида натрия. Инкубацию срезов проводят в течение 30 мин при 37^oC в чашках Петрия с созданием условий влажной камеры (на дно чашки укладывают фильтровальную бумагу, смоченную ЗФР). Две порции ЗФР по 5 мин в каждой, после чего раствор ЗФР меняют на новый. Инкубируют гистологические срезы во вторичных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЗФР в течение 30 мин. ЗФР 5 мин. Обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 мин. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЗФР. ЗФР 5 мин. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03%-ном растворе субстрата в течение 10 мин. Раствор получают смешивая непосредственно перед применением 1 мг ДАБ с 2 мл ЗФР и 0,2 мл 0,3%-ной перекиси водорода. Реакцию останавливают споласкиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Результат читают под разными увеличениями светового микроскопа по наличию окраски цитоплазмы клеток в опытных микропрепаратах и "положительном контроле", при отсутствии окраски - в "отрицательном контроле". Использование способа показало, что цитоплазма эпителия протоков и долек нормальной ткани молочной железы не имеет окраски. В очагах гиперплазии цитоплазма эпителиальных структур окрашена в золотисто-желтый цвет. Разные клетки данной зоны имеют неравномерную окраску, что объясняется различной степенью их гиперплазии. Полученные данные позволяют объективнее различать зоны интактного и гиперплазированного эпителия, за счет чего повышается точность диагностики гиперпластических процессов в молочной железе.

Пример 2. Иммуногистохимическая детекция АБГ в ткани рака молочной железы.

Фрагмент операционного материала фиксируют в водном нейтральном растворе формалина 15%-ной концентрации в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающейся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 мин, три порции 70% и 80%-ного этанола по 6 ч в каждой, три порции 96%-ного этанола по 6 ч в каждой, абсолютный спирт 30 мин, абсолютный спирт-ксилол в равных соотношениях в течение 2 ч, ксилол-парафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 ч, три порции парафина при температуре 58^oC по одному часу в каждой. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе и наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5-8 мкм готовят с помощью микротома. Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 мин в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при 37^oC в течение 3 ч. Обезвоживание гистологических срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола (абсолютный, 96, 70 и 56%-ный) по три минуты в каждой.

Далее срезы переводят на 5 мин в 0,05 M раствор ЗФР с pH 7,6. Блокирование эндогонной пероксидазы (этот и последующие этапы реакции проводят в чашках Петри) осуществляют свежим раствором 3%-ной перекиси водорода. Длительность этапа 10 мин. ЗФР 5 мин. Далее выдерживают срезы под каплей 5%-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина (50 мг альбумина в 1 мл ЗФР). После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно отбирают предметные стекла вокруг срезов. На последние наносят каплю аффинно-очищенных кроличьих первичных антител против АБГ в концентрации 8 мкг/мл ЗФР. Раствор антител включает в себе 3% альбумина и 0,01% азида натрия. Инкубацию срезов осуществляют в течение 30 мин при 37^oC в чашках Петри с созданием условий влажной камеры (на дно чашки укладывают фильтровальную бумагу, смоченную ЗФР). Две порции ЗФР по 5 мин в каждой, после чего раствор ЗФР меняют на новый. Инкубируют гистологические срезы во вторичных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЗФР в течение 30 мин. ЗФР 5 мин. Обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 мин. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЗФР. ЗФР 5 мин. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03%-ном растворе субстрата в течение 10 мин. Раствор получают смешивая непосредственно перед использованием 1 мг ДАБ с 2 мл ЗФР 0,2 мл 0,3%-ной перекиси водорода. Реакцию останавливают споласкиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Далее срезы проводят через свежие восходящей концентрации (56, 70, 96%-ный и абсолютный спирт) и три порции ксилола путем тщательного споласкивания в каждой жидкости. Затем срезы заключают в бальзам.

Результат: цитоплазма опухолевых клеток отчетливо и равномерно окрашена в желто-коричневый цвет, что объясняется, учитывая абсолютную специфичность метода, наличием в ней АБГ.

Вывод. Предлагаемый способ позволяет с высокой специфичностью и относительной простотой проводить дифференциальную диагностику гиперпластических процессов и рака молочной железы в гистологических срезах. Патоморфологическая диагностика злокачественных новообразований, как известно, является на сегодня наиболее информативной. Способ имеет определенное прикладное значение, так как позволяет облегчить, улучшить и объективизировать, т.е. повысить точность процесса гистологической диагностики рака молочной железы, особенно неинфильтрирующихся его форм, диагностика которых представляет до сих пор значительные трудности в работе практических патологоанатомов.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и патологической анатомии. Способ основан на окраске цитоплазмы паренхиматозных клеток в гистологических срезах. При указанном способе диагностики проводят детекцию ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина путем иммуногистохимической реакции с использованием первичных антител против ассоциированного с беременностью альфа₂ - гликопротеина в концентрации 8-10 мкг/мл.

Способ дифференциальной диагностики гиперпластических процессов и рака молочной железы, включающий иммуногистохимическое исследование паренхиматозных клеток их тканей на гистологических окрашенных срезах, отличающийся тем, что при проведении иммунопероксидазной окраски гистоструктур микропрепарата используют на этапе обработки гистологических срезов первичные антитела против ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина в концентрации 8 - 10 мкг/мл и при наличии неравномерной окраски цитоплазмы клеток золотисто-желтого цвета диагностируют гиперпластический процесс в молочной железе, а при наличии равномерной окраски коричневого цвета - рак.