НАБОР ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/569 G01N33/556 A61K39/175 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к получению набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Известен эритроцитарный диагностикум для определения антител к вирусу чумы плотоядных в РНГА на основе нативных эритроцитов барана, сенсибилизированных культуральной вирусосодержащей жидкостью вируса чумы плотоядных штамма "ЭПМ", культивируемого в культуре клеток эмбриона перепела, с титром не ниже 4,5 ТЦД₅₀ в см³ [1].

Однако известный диагностикум характеризуется низкой специфичностью и активностью, срок хранения его 3 - 5 дней, т.к. он не стабилен.

Низкая активность и специфичность известного диагностикума обусловлена тем, что для его получения используют нативную культуральную вируссодержащую жидкость, включающую большое количество невирусных, балластных белков, а малый срок пригодности обусловлен тем, что для его изготовления берут нативные эритроциты барана. Такой диагностикум готовили непромышленно, в связи с чем он не мог быть стандартизирован и поэтому не нашел практического применения.

Технической задачей изобретения является получение стабильного, пригодного для длительного хранения (8 - 10 мес) высокоактивного и специфичного набора диагностикумов для выявления антител в сыворотках крови больных и переболевших животных к вирусу чумы плотоядных в РНГА.

Технический результат изобретения заключается в повышении чувствительности, специфичности, стабильности предлагаемого набора эритроцитарных диагностикумов, которые теперь могут быть стандартизованы.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных содержит следующие компоненты: специфический эритроцитарный диагностикум на основе стабилизированных эритроцитов, сенсибилизированных экстрактом вируса чумы плотоядных; контрольный эритроцитарный диагностикум на основе стабилизированных эритроцитов, сенсибилизированных экстрактом из не зараженной вирусом культуры клеток; специфическую сыворотку к вирусу чумы плотоядных с известным титром антител; контрольную сыворотку, отрицательную к вирусу чумы плотоядных; разбавитель для реакции, например буферный раствор.

Для приготовления специфического диагностикума эритроциты, например эритроциты барана, стабилизируют, например, акролеином, танизируруют и сенсибилизируют антигеном, полученным экстрагированием белков вируса чумы плотоядных тритоном Х-100 из клеток, зараженных вирусом. Количество антигена для сенсибилизации измеряется спектрофотометрически при длине волны 280 нм и колеблется в пределах 0,6 - 0,8.

Контрольный эритроцитарный диагностикум готовят аналогично, но для сенсибилизации акролеинизированных и танизированных эритроцитов используют контрольный антиген, который получают экстрагированием белков из не зараженной вирусом культуры клеток тритоном Х-100. Концентрация белка контрольного антигена равна концентрации вирусного антигена.

Для изготовления диагностикумов можно использовать эритроциты любого вида животного, однако преимущественно использовать эритроциты барана. Для стабилизации эритроцитов могут быть использованы также и другие фиксаторы, например формальдегид.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для изготовления специфического эритроцитарного диагностикума в культуре клеток эмбриона перепела выращивают вирус чумы плотоядных, штамм ЭПМ, с титром 3-5 ТЦД_50/МЛ. Вируссодержащую жидкость сливают, монослой экстрагируют раствором тритона Х-100 в течение 30-60 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве антигена. Эритроциты барана стабилизируют акролеином, готовят 3%-ную суспензию на фосфатном буфере, танизируют, а затем сенсибилизируют антигеном (экстрактом) вируса чумы плотоядных.

Активность полученной серии определяют в РНГА со специфической сывороткой, имеющей известный титр в реакции нейтрализации.

Контрольный эритроцитарный диагностикум готовят точно так же, однако в качестве антигена используют экстракт из не зараженной вирусом культуры клеток.

Гипериммунизацией продуцентов получают специфическую сыворотку к вирусу чумы плотоядных и определяют ее специфическую активность в реакции нейтрализации (титр антител).

В состав набора включают также контрольную сыворотку, отрицательную к вирусу чумы плотоядных, и разбавитель для реакции - солевой раствор, в частности буферный раствор.

Результаты испытаний полученных серий показали высокую активность набора эритроцитарных диагностикумов. Специфичность проверяли с использованием гипериммунных сывороток к другим вирусам, а также с сыворотками, специфичными к антигеннородственным вирусам: кори и чуме крупного рогатого скота.

Сыворотки, в которых не было антител к вирусу чумы плотоядных, отрицательны в РНГА, сыворотки антигенно-родственных вирусов были положительными.

Активность эритроцитарных диагностикумов сохраняется в течение 9 мес. (срок наблюдения).

Набор стабильно дает хорошо воспроизводимую реакцию. Параллельное титрование одной сыворотки в течение недели дает результаты, отличающиеся на одно разведение.

Пример 2. Набор эритроцитарных диагностикум апробирован на полевом материале, т.е. на сыворотках, взятых от больных животных с клиническими признаками чумы, а также от животных, в конъюнктивальных соскобах которых были выявлены антигены вируса чумы плотоядных методом иммунно-флуоресцентного анализа (ДОТ-ИФА).

У животных с лабораторно подтвержденным диагнозом чумы при исследовании парных сывороток, взятых с интервалом 5 - 6 дней выявлен 4-х и более кратный прирост антител.

У животных с клиническими признаками "чумаподобного" заболевания диагноз подтвержден в 68% случаев. Следует отметить, что у взрослых животных резко возрастает титр ингибиторов, который выявляется с помощью контрольного эритроцитарного диагностикума.

Предлагаемый набор позволяет быстро и эффективно выявить антитела в крови больных и переболевших животных, поставить ретроспективный диагноз, а также оценить антигенную активность выпускаемых вакцин.

Экономическая эффективность от применения набора складывается из предотвращения ущерба от неправильно выбранного лечения, возможности использования специфической сыворотки или иммуноглобулина с наибольшим эффектом, возможности выбора правильной тактики дальнейшей профилактики заболеваний, клинические проявления которых сходны с клиническими признаками, вызываемыми вирусом чумы благодаря быстрому, высокочувствительному, специфичному, надежному, воспроизводимому набору диагностикумов.

Кроме того, предлагаемый набор отличается простотой, не требует применения дорогостоящего оборудования, не загрязнен белками, содержащимися в культуральной жидкости, на качество антигена не влияет сыворотка крупного рогатого скота, которая является одним из компонентов питательной среды, на которой наращивается вирус.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии, а именно к получению набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плодоядных в реакции непрямой гемагглютинации. Набор содержит специфический и контрольный эритроцитарные диагностикумы, отрицательную и положительную сыворотки и разбавитель для реакции. Специфический эритроцитарный диагностикум получен сенсибилизацией стабилизированных эритроцитов вируссодержащей жидкости. Контрольный эритроцитарный диагностикум получен сенсибилизацией стабилизированных эритроцитов экстрактом из незараженной культуральной жидкости. Полученный набор пригоден для длительного хранения, высоко активен и специфичен. 2 з.п.ф-лы.

1. Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации, отличающийся тем, что содержит следующие компоненты: специфический эритроцитарный диагностикум на основе стабилизированных эритроцитов, сенсибилизированных экстрактом вируса чумы плотоядных; контрольный эритроцитарный диагностикум на основе стабилизированных эритроцитов, сенсибилизированных экстрактом из не зараженной вирусом культуры клеток; специфическую сыворотку к вирусу чумы плотоядных с известным титром антител; контрольную сыворотку, отрицательную к вирусу чумы плотоядных; разбавитель для реакции на основе солевого раствора. 2. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит специфический и контрольный эритроцитарные диагностикумы на основе стабилизированных акролеином эритроцитов барана. 3. Набор по п. 1, отличающийся тем, что из солевых растворов содержит буферный раствор.