СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ R-БРУЦЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) Российский патент 2011 года по МПК A61K39/10 G01N33/531 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению биологических препаратов.

Известен «Способ получения R-брупеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации», суть которого заключается в следующем. Девитализованную бакмассу штамма В. abortus 16/4 центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20-30 минут, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бакмассу, выпавщую в осадок, воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1. Бакмассу с фенолом выдерживают 30-40 минут при 80-85°С в водяной бане, после чего к ней добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°С, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. Смесь фильтруют и проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против 10 объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализат используют в качестве R-антигена для нагрузки формалинизированных и танизированных эритроцитов барана (Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных и Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, авторы: Л.В.Дегтяренко, автореф., диссерт., д.в.н., 2005, А.П.Красиков, автореф., диссерт., д.в.н., 1996 и др.).

Недостатком данного способа является слабая активность диагностикума, изготовленного этим способом, в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, зараженного R-формами бруцелл. Кроме того, данный диагностикум в отдельных случаях спонтанно агглютинируется в РНГА с нормальной кроличьей сывороткой, используемой в качестве стабилизатора для разведения исследуемых сывороток крови животных. Учитывая изложенное, мы решили разработать способ получения высокоактивного и специфического R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА, лишенного указанных недостатков.

Целью изобретения является повышение активности и специфичности бруцеллезного R-диагностикума для РНГА. Эта цель достигается механическим разрушением целостности микробных клеток B.abortus штамма 16/4 (без химического воздействия), используемых для получения антигена для РНГА путем тщательного растирания бакмассы бруцелл в ступке.

Изготовление R-антигена (сенситина)

Культуру бруцелл штамма B.abortus 16/4, 3-суточного роста, выращиваемую на мясопептоннопеченочном глюкозоглицериновом агаре, смывают с поверхности питательной среды стерильным физиологическим раствором. Полученную бакмассу центрифугируют при 6000 об/мин в течение 1-го часа. Надосадочную жидкость удаляют, а микробные клетки, выпавшие в осадок, помещают в ступку и подвергают механическому разрушению путем тщательного растирания. Затем к бакмассе добавляют небольшое количество физиологического раствора и ее нагревают в водяной бане при температуре 80-90°С в течение 35-40 минут, после чего концентрацию бруцелл бакмассы доводят до 100 млрд микробных клеток в 1 мл физиологическим раствором и подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 1-го часа. Полученный экстракт (сенситин) после определения его активности путем титрации используют для сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов.

Титрация R-бруцеллезного антигена (сенситина)

Для каждой серии формалинизированных и танизированных эритроцитов определяют минимальную дозу R-бруцеллезного антигена (сенситина), необходимую для получения R-диагностикума с оптимальной активностью.

Предварительно к осадку танизированных эритроцитов добавляют 5%-ный раствор хлорида натрия до получения 5-процентной взвеси и туда же вносят 0,25% - детергента вторичного алкилсульфата натрия. После чего проводят их сенсибилизацию возрастающими дозами R-антигена при температуре 45-50°С в течение одного часа. Для этого в пробирки с 1 мл 5%-ной взвеси эритоцитов добавляют 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5... до 4,0 мл R-антигена, изготовленного указанным выше способом. Смесь перемешивают и выдерживают в водяной бане в течение одного часа при 45-50°С. После этого сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают от избытка R-антигена физиологическим раствором с добавлением к нему 1% нормальной инактивированной кроличьей или 2,5% лошадиной сыворотки крови. Затем в каждую пробирку с осадком отмытых сенсибилизированных эритроцитов вносят по 2 мл физиологического раствора со стабилизатором (свежая кроличья или лошадиная сыворотка крови). Полученные 2,5%-ные взвеси эритроцитов, сенсибилизированных разными дозами R-антигена (R-сенситина), гомогенизируют встряхиванием пробирок и проверяют в РНГА на активность и специфичность.

Для контроля активности и специфичности R-диагностикума применяют R-позитивную и негативную сыворотки. Из позитивной сыворотки готовят разведения (физраствором с добавлением в качестве стабилизатора сыворотки крови кролика (1%) или лошади (2,5%) 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800 и 1:25600, а негативную сыворотку разводят 1:50, 1:100, 1:200. Все разведения сыворотки крови инактивируют путем прогревания в водяной бане при 60-62°С в течение 30 минут, после чего их переносят в лунки полистироловой пластины в объеме 0,5 мл и к ним добавляют по 0,05 мл взвеси сенсибилизированных эритроцитов (R-диагностикума). Содержимое пластинок тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 3-4 часа, после чего проводят учет реакции (табл.1).

Таблица 1 Результаты проверки активности и специфичности R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в РНГА Количество антигена (сенситина) на 1 мл 5% взвеси эритроцитов Титры РИГА Кроличья сыворотка с позитивной R-сывороткой с негативной сывороткой   1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:50 1:100 1:200 1:100 0,5 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + - - - - - - - 1,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + - - - - - - 1,5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + - - - - - 2,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ + - - - - 2,5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - - - - 3,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - - - - 3,5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + - - 4,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + - -

Из приведенных данных в таблице 1 видно, что использование для нагрузки эритроцитов сенситина (антигена), извлеченного путем механического разрушения целостности микробных клеток В.abortus 16/4, позволяет готовить высокоактивный и специфичный R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум. Наименьшей дозой сенситина (антигена), необходимой для получения эритроцитарного диагностикума с высокой активностью и специфичностью, является 2,5 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси стабилизированных и танизированных эритроцитов барана. Такую дозу берут для изготовления диагностикума.

Изготовление R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА

R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум готовят путем сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана антигеном (сенситином), извлеченным из бруцелл инагглютинабельного штамма В.abortus 16/4 механическим разрушением микробных клеток по описанному выше способу.

Предварительно определяют минимальную сенсибилизирующую дозу R-антигена (сенситина) путем его титрации на эритроцитах при оптимальном режиме (см. титрация R-антигена), для чего к 1 мл 5%-ных формалинизированных и танизированных эритроцитов добавляют 5% хлорида натрия, 0,25% вторичного алкилсульфата натрия и антигена (сенситина) в минимальной оттитрованной дозе. Сенсибилизацию эритроцитов проводят путем выдерживания смеси в водяной бане при температуре 45-50°С в течение одного часа при периодическом встряхивании через 5-8 минут. Затем сенсибилизированные эритроциты отмывают от избытка сенситина в течение 30 минут три раза кроличьей сывороткой, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:100 и прогретой при 60°С. Физраствор с кроличьей сывороткой для отмывания берут в десятикратном объеме. После отмывания к осадоку эритроцитов добавляют физиологический раствор со стабилизатором (кроличья или лошадиная сыворотка) в количестве, необходимом для получения 5%-ной взвеси эритроцитов. Затем их консервируют путем добавления 0,3% формальдегида и проверяют в РНГА на активность и специфичность. Готовый препарат хранят в холодильнике при 4-6°С.

Испытание R-диагностикума в сравнении с аналогичным препаратом, изготовленным по методике ВНИИБТЖ и ИЭВС и ДВ

Активность и специфичность R-диагностикума, изготовленного по разработанному нами способу (R-диагностикум Прикаспийского зонального НИВИ), проверяли в сравнении с аналогичным препаратом ВНИНБТЖ, ИЭВС и ДВ (прототип).

Для испытания R-диагностикумов в РНГА исследовали бруцеллезные R и S-сыворотки, а также сыворотки крови, взятой от 2-х заведомо здоровых и 2-х привитых вакциной из штамма 82 коров, спустя 15 дней после иммунизации (табл.2).

Таблица 2 Результаты проверки активности и специфичности R-диагностикумов в РНГА Сыворотки крови Результаты исследования сыворотки крови в РНГА с R-диагностикумом Прикасп. ЗНИВИ с R-диагностикумом ВНИИБТЖ и ИЭВС и ДВ S-дигностикумом R-положительная 1:25600++++ 1:6400++++ 1:200+++ S-положительная 1:200+++ 1:200+++ 1:51200++++ От коровы, вакцинирован. шт. 82 1:1600+++ 1:800+++ 1:400++++ От коровы, вакцинирован. шт. 82 1:1600++++ 1:400+++ 1:200+++ Негативная отр. 1:50+++ отр. Негативная отр. 1:25++++ отр.

Как видно из таблицы 2, при исследовании в РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом, изготовленным по разработанному нами способу (R-диагностикум Прикасп. ЗНИВИ), титр РНГА с R-положительной сывороткой составлял 1:25600 и с сыворотками крови коров, привитых вакциной из штамма 82-1:1600, тогда как с этими же сыворотками с R-диагностикумом ВНИИБТЖ и ИЭВС и ДВ получена РНГА в титрах 1:6400 и 1:400-1:800.

Диагностикум, изготовленный по новой методике, обладал более высокой специфичностью, о чем свидетельствуют результаты исследования негативных сывороток в РНГА с обоими R-диагностикумами.

При исследовании высокоактивной S-сыворотки, содержащей специфические антитела в титре 1:51200, получена РНГА с R-диагностикумами в разведении 1:200. Примерно такие же результаты получены при исследовании сывороток крови коров, привитых вакциной из штамма 82. Средний титр R-антител у вакцинированных против бруцеллеза коров в 2-4 раза превышал уровень S-антител. В то же время у реиммунизированных вакциной из штамма 82 и зараженных бруцеллезом животных спустя 12 месяцев после ревакцинации в сыворотке крови содержались S-антитела в высоких титрах, а титры R-антител, выявленных РНГА с R-диагностикумами, не превышали 1:100 (табл.3).

Таблица 3 Результаты исследования сывороток крови коров неблагополучного по бруцеллезу хозяйства в РНГА с S- и R-диагностикумами спустя 12 месяцев после реиммунизации вакциной из штамма 82 № п/п № животных Титр РНГА с PCK c R-диагностикумом Прикасп.ЗНИВИ S-диагностикумом S-антигеном 1 5138 1:50 1:400 1:10 2 5117 1:50 1:800 1:40 3 5388 1:100 1:1600 1:80 4 7625 1:100 1:400 1:10 5 5316 1:100 1:800 1:40 6 7524 1:50 1:800 1:40 7 5372 1:100 1:400 1:20 8 7505 1:100 1:3200 1:640 9 368 1:100 1:3200 1:320 10 1793 1:100 1:3200 1:320 11 5104 1:100 1:800 1:40 12 5113 1:100 1:200 1:10 13 5173 1:50 1:400 1:10 14 5394 1:100 1:800 1:40 15 1088 1:100 1:1600 1:80 16 5144 1:100 1:400 1:20 17 6258 1:100 1:3200 1:80 Контроль отриц. отр. отр. отр. Позит. S-сывор. 1:100 1:3200 1:320 Позит. R-сывор. 1:25600 1:100 отр.

У животных благополучных по бруцеллезу хозяйств (25 гол.) с отрицательными PA, PCK и РБП в отдаленные сроки после реиммунизации вакциной из штамма 82, показания РНГА как с S-, так и R-диагностикумами были также отрицательными, что свидетельствует о специфичности R-диагностикума, изготовленного по разработанному способу (табл.4)

Таблица 4 Результаты исследования сывороток крови коров благополучного по бруцеллезу хозяйства в РА, РСК, РБП и РНГА с S- и R-диагностикумами через 12 месяцев после реиммунизации вакциной из штамма 82 Исследовано голов РА РСК РБП РНГА с S-диагностикумом РНГА с R-диагностикумом Прикасп. ЗНИВИ 25 отр. отр. отр. отр. отр.

Таким образом, в результате проведенных исследовании установлено, что путем механического разрушения целостности (без химического воздействия) микробных клеток штамма 16/4 B.abortus и сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана извлеченным из них экстрактом, из расчета 2,5 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов, удается получить высокоактивный и специфичный (по сравнению с аналогом) R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум для РНГА.

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает изготовление R-антигена из бруцелл штамма B.abortus 16/4, определение его активности путем титрации, изготовление формалинизированных и танизированных эритроцитов барана и последующую сенсибилизацию формалинизированных и танизированных эритроцитов барана оттитрованным R-антигеном. При этом для изготовления R-антигена трехсуточную культуру бруцелл штамма B.abortus 16/4 смывают с поверхности питательной среды стерильным физиологическим раствором и центрифугируют. Выпавшие в осадок микробные клетки подвергают механическому разрушению путем тщательного растирания, а сенсибилизацию формалинизированных и танизированных эритроцитов барана оттитрованным R-антигеном осуществляют путем выдерживания их смеси при температуре 45-50°С в течение одного часа. Способ позволяет получить обладающий высокой активностью и специфичностью R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум. 4 табл.

Способ получения R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), включающий изготовление R-антигена из бруцелл штамма В.abortus 16/4, определение его активности путем титрации, изготовление формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, последующую сенсибилизацию формалинизированных и танизированных эритроцитов барана оттитрованным R-антигеном, отличающийся тем, что для изготовления R-антигена трехсуточную культуру бруцелл штамма В.abortus 16/4 смывают с поверхности питательной среды стерильным физиологическим раствором, центрифугируют, после чего выпавшие в осадок микробные клетки подвергают механическому разрушению путем тщательного растирания, а сенсибилизацию формалинизированных и танизированных эритроцитов барана оттитрованным R-антигеном осуществляют путем выдерживания их смеси при температуре 45-50°С в течение одного часа.