СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИТЕЛЬНОГО ОВИСНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) С ЦЕЛЬЮ ИНДИКАЦИИ ОВИСНОГО АНТИГЕНА В БИОМАТЕРИАЛЕ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/555 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного овисного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации для индикации овисного антигена в биоматериале.

В доступной нам литературе мы не нашли данных по получению овисного эритроцитарного антительного диагностикума для РНГА. Поэтому в качестве аналога мы использовали для индикации овисного антигена в биоматериале реакцию нейтрализации антител (РНАт) и бактериологический метод.

Постановка РНАт

Растворителем исследуемого материала и всех ингредиентов для РНАт является нормальная, инактивированная кроличья сыворотка, разведенная 1:100 в 0,85%-ном растворе NaCl; рН-7,1. В реакции используют 2,5%-ную рабочую взвесь сухого овисного эритроцитарного антигенного диагностикума, разведенного 0,85%-ным раствором NaCl. Реакции ставят в прозрачных полистироловых планшетах с лунками в четыре ряда: первый -опытный (8-10 лунок), остальные - контрольные (по 6 лунок). Исследуемый материал титруется в объеме 0,25 мл.

Затем в 1 и 2 лунки 1-опытного и второго-контрольного - рядов вносят по 0,25 мл исследуемого материала и разводят его с индексом 2. В третий (контрольный) ряд вносят бруцеллезный антиген в объеме 0,25 мл и также разводят с индексом 2. В качестве антигена используют взвесь убитых B.ovis в концентрации 5x108 микробных клеток. Во все лунки 1-го (опытного) и 3-го (контрольного) рядов добавляют по 0,25 мл позитивной овисной сыворотки в разведении, соответствующем 4 сывороточным (гемагглютинирующим) единицам (например, 1:800).

Определение величины минимальной гемагглютинирующей единицы специфической сыворотки проводят перед постановкой РНАт. За одну сывороточную (гемагглютинирующую) единицу принимают предельное разведение овисной сыворотки в РНГА (например, 1:3200), вызывающее четкую агглютинацию эритроцитов на 4 креста.

Во все лунки второго (контрольного) ряда добавляют 0,25 мл 1%-ной нормальной сыворотки кролика. В четвертом (контрольном) ряду разводят овисную позитивную сыворотку в объеме 0,5 мл с индексом 2, начиная с разведения, которое было использовано в первом (опытном) и третьем (контрольном) рядах и проверяют соответствие разведения свыоротки 4-м сывороточным единицам (например, 1:800). В четвертом ряду реакция должна быть позитивной не менее, чем в 2-4-х начальных разведениях сыворотки. Планшеты встряхивают и ставят в термостат при 37°-38°C на 2 часа. Затем во все лунки четырех рядов добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2,5%-ной взвеси овисного антигенного эритроцитарного диагностикума. Планшеты встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 3-4 часа. При наличии овисного антигена в исследуемом материале эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки» или маленького колечка - реакция нейтрализации положительная. Если в исследуемом материале антиген отсутствует, то специфические антитела, добавленные в реакцию, остаются свободными и склеивают сенсибилизированные эритроциты - реакция нейтрализации отрицательная. Эта реакция достаточно сложная, 3-компонентная (эритроцитарный антигенный овисный диагностикум+позитивная овисная сыворотка+иссленуемый материал), однако, она проще, по сравнению с патологическим материалом.

Преимущество РНАт заключается в возможности выявления антигена в патологическом материале, непригодном для бактериологического исследования.

Недостатками РНАт являются ее слабая чувствительность, затраты времени для ее исполнения для индикации B.ovis антигена в биоматериале и достаточно сложная методика постановки. Бактериологическое исследование при инфекционном эпидидимите баранов связано с большими затратами времени, необходимого для выявления возбудителя из биоматериала и дальнейшей ее индикации. Культуральные особенности B.ovis требуют специальных питательных сред и особых условий для роста. Поэтому мы решили разработать способ получения высокоактивного, специфичного, несложного по технологии изготовления, простого по технике постановки реакции и малозанимающего времени для проведения исследования овисного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА, лишенного указанных недостатков.

Повышение активности и упрощение технологии получения овисного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА достигается тем, что сенсибилизация стабилизированных эритроцитов с помощью коньюгатов водорастворимого ализаринового синего индикатора (АСИ) проводится по параметрам концентрации ингридиентов, pH, ионной силы среды, температуры и экспозиции.

Максимальная чувствительность и специфичность РНГА получается при следующих соотношениях ингридиентов: один объем 10%-ной взвеси эритроцитов, один объем позитивной овисной сыворотки в рабочем разведении (1:200 1:400) инактивированной при 60°С в течение 30 минут. Затем добавляют один объем свежеприготовленного водного 0,1-0,11%-ного раствора АСИ. Смесь встряхивают и выдерживают в течение 60 минут при 45°С, периодически перемешивая. После этого эритроциты отмывают 0,85%-ным раствором NaCl, содержащим 0,5% нормальной сыворотки крови кролика, инактивированной при 60°С в течение 30 минут, pH - 7,0-7,2. По окончании отмывания, путем центрифугирования, взвесь эритроцитов вносят в физиологический раствор с целью получения 2,5%-ной концентрации эритроцитов.

Получаемый при этом антительный овисный эритроцитарный диагностикум обладает высокой чувствительностью в РНГА и специфичность. Благодаря эффективности метода при низкой активности антител в рабочих растворах сывороток - сенситин - возможно получение антительных диагностикумов на основе малоактивной сыворотки.

Предварительно активность изготовленных антительных диагностикумов проверяли в РНГА, при исследовании овисного антигена для РДСК (реакция длительного связывания комплемента), приготовленного ООО НПФ «Биоцентр», г.Омск, в предельных разведениях. При этом РНГА приготовленного нами диагностикума выявила овисный антиген - 0,045 мг антигена в 1 мл или 0,0225 мг в 0,5 мл, так как реакция ставится в объеме 0,5 мл.

Специфичность РНГА диагностикума изучали путем исследования лимфоузлов и органов от 10 здоровых баранов (240 объектов) и 4 овцематок, привитых вакциной из штамма B.melitensis Rev-1 (60 объектов). Всего исследовали 300 проб, и во всех случаях были получены отрицательные результаты, что подтверждает высокую специфичность РНГА с приготовленным нами овисным антительным эритроцитарным диагностикумом.

Убедившись в специфичности РНГА с антительным эритроцитарным овисным диагностикумом (Прикаспийского зонального НИВИ), мы исследовали патологический материал (лимфатические узлы и паренхиматозные органы) 10 баранов (53 объекта) из неблагополучного по инфекционному эпидидимиту хозяйства и 20 морских свинок (123 объекта), экспериментально зараженных культурой B.ovis. Исследование проводили бактериологическим методом, РНАт и РНГА с антительным диагностикумом Прикаспийского зонального НИВИ (табл.).

Проводили испытание антительного овисного эритроцитарного диагностикума, в сравнении с реакцией нейтрализации антител и бактериологическим методом. Результаты исследования представлены в таблице.

Результаты исследования РНГА, РНАт, бактериологическим методом биологического материала от животных в различной эпизоотической ситуации

  Группы животных Количества исследованных Выделено культур Положительная РНАт Положительная РНГА с диагн. Прикасп. ЗНИВИ жив-х объектов всего % всего % всего % 1. Бараны-производители из хозяйств, неблагополучных по инфекционному эпидидимиту 10 53 13 24,5 24 45,2 32 60,3 2. Морские свинки, зараженные культурой B.ovis 20 123 9 7,5 62 50,4 120 97,5 3. Единый бруцеллезный стандартный антиген для РА, РСК и РДСК (S-формы) - 1 - - отр. - отр. - 4. Антигены, изготовленные из штаммов бруцелл 16/4 и 1096 (R-формы) - 2 - - 2 100 2 100 5. Антиген B.ovis биофабричного приготовления (R-формы) - 1 - - 1 100 1 100   Всего: 30 180 22 12,5 89 48,9 155 86,4

Как видно из таблицы, при исследовании 176 объектов патологического материала от 30 животных из групп с различной эпизоотической ситуацией, положительные результаты в РНГА были получены в значительно большем числе случаев, чем бактериологическим методом и РНАт, что свидетельствует о более высокой чувствительности РНГА с антительным диагностикумом.

Чувствительность и специфичность РНГА с овисным антительным эритроцитарным диагностикумом проверяли путем исследования единого бруцеллезного антигена для PA, PCK и РДСК (S-формы), антигенов, изготовленных из штаммов В.abortus 16/4, 1096 (R-формы) и овисного антигена биофабричного приготовления.

В результате испытания отмечена высокая активность при исследовании гомологичного (овисного) антигена, тогда как с единым бруцеллезным антигеном для PA, PCK, РДСК (S-формы) получены отрицательные результаты.

Кроме того, было установлено, что овисный антительный диагностикум в РНГА также выявляет бруцеллезный антиген в R-форме, так как B.ovis находится в стойкой R-форме.

Литература

Абуталипов А. Сравнительная диагностическая эффективность РИД, РНАт и бактериологического метода при бруцеллезе. Вестник с/х науки Казахстана, 1982, №5, с.75-77.

Ромахов В.А. Разработка и совершенствование средств, методов диагностики и системы мероприятий по борьбе с инфекционным эпидидимитом баранов и бруцеллезом животных. Дисс. д.в.н. в форме научного доклада, 1992.

Садыков С.Ж. Диагностическая эффективность РНГА и РНАт при бруцеллезе, «Ветеринария», 1974, №6, с.107-108.

Хаиров С.Г., Юсупов О.Ю. Испытание эритроцитарного антигена в РНАт и РТНГА. Материалы юбелейн. научно-практ. конф. ГНУ Прикасп. ЗНИВИ, Махачкала - 2003. С.42-44.

Чернышева М.И. с соавт. Сухой эритроцитарный диагностикум для реакции пассивной гемагглютинации и РНАт при бруцеллезе, ЖМЭИ, 1970, №12, с.171.

Изобретение относится к области ветеринарии. Раскрыт способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с целью индикации овисного антигена в биоматериале. Способ осуществляют посредством приготовления стабилинизированных эритроцитов, с последующей сенсибилизацией позитивной овисной сывороткой. При этом для изготовления эритроцитарного антительного диагностикума позитивную овисную сыворотку для сенсибилизации стабилизированных эритроцитов разводят 1:200-1:400, инактивируют при 60°C в течение 30 минут, сенсибилизируют формалинизированные эритроциты из расчета: один объем 10%-ной взвеси эритроцитов, один объем позитивной овисной сыворотки в рабочем разведении (1:200-1:400), инактивированной при 60°C в течение 30 минут. Затем добавляют один объем свежеприготовленного водного 0,1-0,11%-ного раствора водорастворимого ализаринового синего индикатора. Смесь встряхивают и выдерживают в течение 60 минут при 45°C, периодически перемешивая. Способ позволяет получить обладающий высокой активностью и специфичностью эритроцитарный овисный антительный диагностикум. 1 табл.

Способ получения эритроцитарного антительного овисного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для индикации B.ovis антигена в биоматериале, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана с последующей сенсибилизацией позитивной овисной сывороткой, отличающийся тем, что впервые позитивную овисную сыворотку для нагрузки формалинизированных эритроцитов разводят 1:200-1:400, инактивируют при 60°C в течение 30 мин, добавляют один объем свежеприготовленного 0,1-0,11%-ного раствора водорастворимого ализаринового синего индикатора (АСИ), смесь встряхивают и выдерживают в течение 60 мин при 45°C, периодически перемешивая, после этого эритроциты отмывают 0,85%-ным раствором NaCl, содержащим 0,5% нормальной сыворотки крови кролика, инактивированной при 60°C в течение 30 мин, pH - 7,0-7,2, по окончании отмывания, путем центрифугирования, взвесь эритроцитов вносят в физиологический раствор с целью получения 2,5%-ной концентрации эритроцитов.