СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (S)-КЕТОПРОФЕНА Российский патент 1998 года по МПК C12P41/00 

Настоящее изобретение относится к разделению арилалкановых кислот.

Известно, что многие фармацевтически активные соединения, получаемые химическим синтезом, производятся и поступают в продажу в виде смесей стереоизомеров. Однако зачастую лишь один из этих стереомеров является фармацевтически активным. Примесный энантиомер часто обладает очень низкой активностью или вообще не проявляет никакой активности, а в ряде случаев оказывает нежелательное побочное физиологическое воздействие или является токсичным.

Известно, что антивоспалительная активность 2-арилпропионовых кислот напроксена и ибупрофена присуща (S) - энантиомеру. Аналогичная ситуация наблюдается и в случае кетопрофена, который в настоящее время производится и поступает в продажу в виде рацемата.

Арилалкановые кислоты можно разделить путем биотрансформации по следующей схеме:

где R' - алкильная группа, Ar - остаток ароматического углеводорода, а R, например, является остатком алифатического углеводорода, содержащего от 1 до 4 атомов углерода.

Наибольший интерес из арилалкановых кислот представляет (+) -α- (3-бензоилфенил)-пропионовая кислота ((S)-кетопрофен), которую получают путем проведения энантиоселективного синтеза. Данный способ, заключающийся в осуществлении асимметричной гомогенной гидрогенизации α- (3-бензоилфенил)акриловой кислоты, является наиболее близким по технической сущности к заявляемому, и он описан G. Comisso, M.Mihalic etc..., Enantioselective synthesis and absolute confiquration of (+)- α- (3-benzoylphenyl)propionic acid, Gazzetta chimica Italiana, 110, 1980, p. 123 - 127.

Целью настоящего изобретения является экономичный способ получения оптически чистого (S)-кетопрофена.

Поставленная цель достигается способом получения (S)-кетопрофена из рацемической смеси энантиомеров сложного эфира кетопрофена, в котором рацемическую смесь энантиомеров сложного эфира кетопрофена подвергают взаимодействию с микроорганизмом Trichosporon laibacchii, при этом используют микроорганизм, хараткеризующийся способностью селективно превращать рацемическую смесь энантиомеров сложного эфира кетопрофена в (S)-кетопрофен.

Предпочтительно в настоящем изобретении в качестве сложного эфира кетопрофена используют этиловый эфир и/или метиловый эфир.

Предпочтительно используемый микроорганизм представляет собой микроорганизм штамма Trichosporon Laibacchii IMICC 348917.

Предпочтительно способ согласно настоящему изобретению осуществляют при pH 4,5 - 7,5.

Предпочтительно способ осуществляют при температуре 20 - 30^oC.

Способ позволяет достигать селективности до 98%, при этом он прост и экономичен.

Указанный выше способ основывается на биокаталитическом гидролизе сложного эфира рацемического кетопрофена, в ходе которого получают бульон, содержащий кетопрофен в кислотной форме, значительно обогащенной одним энантиомером, и эфир кетопрофена, значительно обогащенный другим энантиомером. При условии, что кислотный продукт биотрасформации в значительной степени обогащен требуемым энантиомером, дальнейшее улучшение оптической чистоты может быть легко и экономично достигнуто при использовании стандартных химических способов путем образования соли с хиральным амином высокой оптической чистоты и последующей кристаллизацией из раствора. Оставшийся после проведения биотрансформации эфир кетопрофена очищают, рацемизируют химическим способом и повторяют цикл для проведения повторной биотрансформации, снижая при этом затраты на исходные материалы.

Достижение поставленной цели настоящего изобретения основывается на открытии биокатализатора, пригодного для проведения указанной выше биотрансформации, а именно микроорганизма (ENZA-13). Микроорганизм был впервые выделен при отборе образцов при работах, связанных с орошением, для выращивания на этаноле в качестве единственного источника углерода. Последующий отбор организмов на пластинах, содержащих этилкетопрофен, показал, что в процессе роста наблюдается интенсивное расщепление нерастворимого в воде этилкетопрофена вокруг колоний ENZA-13 (что указывает на возможный гидролиз эфира). Последующий выбор жидкой среды показал, что ENZA-13 проявляет значительно большую активность при гидролизе этилкетопрофена, чем другие культуры.

Показано, что этот штамм имеет ряд особенностей при получении (S)-кетопрофена из рацемического сложного эфира кетопрофена, а именно топрофена, а именно:
(а) он очень быстро гидролизует сложные эфиры кетопрофена с короткой углеродной цепью;
(б) он образует кислотную форму (S)-кетопрофена из рацемического этилкетопрофена с очень высокой энантиоселективностью так, что при низких уровнях конверсии может быть получен (S)-кетопрофен с чистотой более 95%, при степени превращения, приближающейся к 50% (40 - 50%), оптическая чистота снижается до 90%. Эта селективность достигается без необходимой очистки от посторонних активностей (что может быть весьма дорогим) или воспроизведения нужной активности путем клонирования;
(в) при изменении субстрата от этилкетопрофена к метилкетопрофену можно менять селективность биокатализа так, что вместо (S)-энантиомера будет предпочтительно накапливаться кислотная форма (R)-кетопрофена. Так, при осуществлении биотрансформации более, чем на 50%, (S)-кетопрофен может быть получен в виде метилового эфира;
(г) Организм быстро растет при комнатной температуре со временем удвоения от 1,5 до 2 ч, что позволяет легко и экономично осуществить биокатализ.

Выделенный штамм идентифицирован в Centralbureau Voor Schimmelcultures (CBS) в Голландии как Trichosporon Laibacchii (Windisch), который также классифицируют как Endomyces laibacchii. От CBS могут быть получены несколько альтернативных штаммов этого образца. Эти штаммы, например, CBS 5791, 5790, 5381 и 2495 получены и подвергнуты тем же испытаниям, что и культура ENZA-13. В ходе проведения этих испытаний показано, что некоторые из указанных штаммов обладают при проведении биотрансформаций почти такой же активностью, что и культура ENZA-13. В каталоге CBS1990 года (32-е издание) эти штаммы классифицированы как Trichosporon beigelii, однако они затем переименованы CBS в Endomyces laibacchii. Изученные штаммы T. beigelii показывают при испытаниях селективность, аналогичную ENZA-13, однако они не обладают такой же активностью.

ENZA-13 депонирован 20-го августа 1991 г. в Международном институте микологии (1М1 Кью, Великобритания) на условиях Будапештского соглашения и получил регистрационный номер 348917.

Далее представлены следующие характеристики депонированного ENZA-13:
Ферментативное выращивание:
глюкоза - -ve
Аэробное выращивание:
D-глюкоза - +ve
D-галактоза - +ve
L-сорбоза - +ve
D-глюкозамин - +ve
D-рибоза - +ve
D-ксилоза - +ve
L-арабиноза - +ve
D-арабиноза - -ve
L-рамноза - +ve
сахароза - +ve
мальтоза - +ve
альфа-альфа-трегалоза - +ve
метил-альфа-глюкозид - +ve
целлобиоза - +ve
салицин - +ve
арбутин - +ve
мелибиоза - +ve
лактоза - +ve
раффиноза - +ve
мелезитоза - +ve
инулин - -ve
растворимый крахмал - +ve
глицерин - +ve
мезо-эритрит - -ve
рибит - -ve
ксилит - -ve
L-арабинит - +ve
D-глюцит - +ve
D-маннит - -ve
галактит - +ve
миоинозит - +ve
глюконолактон - -ve
D-глюконат - +ve
D-глюкуронат - +ve
D-галактуронат - -ve
дилактат - +ve
сукцинат - +ve
цитрат - +ve
метанол - -ve
этанол - +ve
Использование источников азота:
нитрат - -ve на нитрате
нитрит - -ve
этиламин - +ve
L-лизин - +ve
кадаверин - +ve
креатин - -ve
креатинид - +ve
Выращивание: +ve при 25^oC, 30^oC; -ve при 35^oC, 37^oC
Внешний вид: колонии - крем, пленкообразные; филаменты - хорошо развитые pseudohyphae septae hyphae arthrocandida; asci - нет; teliospores/basidia - нет.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. В примерах 1 - 5 используют приведенную в табл. 1 среду (в которой получают (S)-кетопрофен).

Кислотность всех сред перед помещением в автоклав доводят до 6,5 с помощью едкого натра. Все среды перед внесением посевного материала подвергают термической стерилизации при температуре 121^oC в течение от 20 до 40 мин. Глюкозу в виде 50%-ного раствора стерилизуют отдельно.

Смесь для биотрансформации включает:
фосфат натрия - 100 мМ, pH 6,5
дрожжевой экстракт - 10 г/л
твин 80 - 5 г/л
пеногаситель (XFO 371) - 1 мл/л
В смесь для биотрансформации добавляют этиловый эфир кетопрофена так, что конечная концентрация после прибавления посевного материала составляет 50 г/л. Среду для проведения биотрансформации подвергают термической стерилизации при 121^oC в течение 20 - 40 мин; этиловый эфир кетопрофена подвергают термической стерилизации отдельно.

Раствор микроэлементов имеет следующий состав:
CaCl₂ • 2H₂O - 3,57 г/л
ZnO - 2,0 г/л
CuCl₂ • 2H₂O - 0,85 г/л
Na₂MoO₄ • 2H₂O - 4,8 г/л
MnCl₂ • 4H₂O - 2,0 г/л
FeCl₂ • 6H₂O - 5,4 г/л
H₃BO₃ - 0,3 г/л
CoCl₂ • 6H₂O - 2,4 г/л
HCl - 250 мл/л
Пример 1. Клетки (ENZA-13) высевают на пластины агара YM (Difco) и выдерживают при температуре 23^oC в течение 2 дн. Колонию затем переносят в 75 мл посевной среды, помещенной в колбу емкостью 500 мл, и при встряхивании выращивают аэробно при температуре 23^oC в течение 24 ч. Затем культуру переносят в ферментатор емкостью 2,8 л, содержащий 1,5 л среды выращивания с температурой 23^oC. Выращивание проводят в течение 10 ч при эффективной аэрации и перемешивании для создания аэробных условий. 150 мл полученной культуры переносят в сосуд емкостью 2,8 л, содержащий 1,35 л среды для проведения биотрансформации. Во время проведения биотрансформации осуществляют перемешивание со скоростью 1200 об/мин и аэрируют со скоростью 0,5 объем/объем в минуту. Температуру поддерживают на уровне 23^oC. Проба, взятая через 20 ч после начала процесса, показывает концентрацию кетопрофена 7 г/л с чистотой (S)-кетопрофена на уровне 98%. Проба, взятая через 73 ч после начала биотрансформации, показывает концентрацию кетопрофена 23,3 г/л с чистотой (S)-кетопрофена на уровне 94%.

Пример 2. Осуществляемые операции аналогичны описанным в Примере 1, но проводятся в большем масштабе.

Клетки высевают на пластинах агара YM (Difco) и выдерживают в течение 2 дн. Колонии переносят в каждую из четырех конических колб емкостью 1 л, содержащих по 250 мл посевной среды. После выращивания в течение 1 дн содержимое всех колб переносят в ферментатор емкостью 15 л, содержащий 9 л среды выращивания. После выращивания в течение 10 ч в аэробных условиях 5 л бульона с культурой переносят в сосуд емкостью 75 л, содержащий 45 л среды для проведения биотрансформации. Для обеспечения аэробных условий и хорошего перемешения скорость подачи воздуха составляет 0,2 объем/объем в минуту, а скорость перемешивания 500 об/мин. Проба, взятая через 71 ч после начала биотрансформации, показывает, что накопилось 17 г/л кетопрофена с чистотой (S)-энантиомера на уровне 93%.

Пример 3. Клетки различных штаммов, которые получены от CBS и приведены в следующей далее таблице, переносят со свежих пластин агара YM в колбы емкостью 250 мл, содержащие по 25 мл среды выращивания без глюкозы. После выращивания в течение 24 ч по 5,0 мл каждой культуры переносят в перемешиваемые колбы емкостью 250 мл, содержащие по 20 мл среды для проведения биотрансформации. Пробы берут после перемешивания при 23^oC в течение 72 ч. Результаты приведены в табл. 2.

Пример 4. Влияние температуры. Исследования показывают, что при температурах 23 и 26^oC поведение биокатализатора в процессе биотрансформации сходное. При 20^oC скорость процесса биотрансформации аналогична скорости трансформации при 23^oC, однако энантиоселективность биокатализатора падает так, что при проведении стандартного процесса биотрансформации (Пример 1) чистота кислотной формы составляет через 70 ч лишь 88% (S)-кетопрофена, а не 93 - 94%. При 30^oC степень конверсии уменьшается на 40 - 50%; энантиоселективность также неудовлетворительная.

Пример 5. Влияние pH. Активность катализатора наблюдается в интервале от 4,5 до 7,5 (и наверняка при больших значениях, однако это не исследовалось). Селективность биокатализатора значительно снижается при pH меньше 4,5. Оптимальное значение pH составляет от 6,5 до 7,5.

Так при использовании стандартной методики (Пример 1) с контролируемым pH 4,5 проба через 66 ч показывает содержание продукта 8 г/л (чистота (S)-кетопрофена составляет 91%); при pH 6,5 через 66 ч - 24 г/л (чистота (S)-кетопрофена составляет 94%); при pH 7,5 через 66 ч - 23 г/л (чистота (S)-кетопрофена составляет 80%);
Пример 6. Влияние длины алкильной цепи. Клетки ENZA-13 выращивают в среде, содержащей 25 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л дигидрофосфата калия, 0,5 г/л гептагидрата сульфата магния, 2 г/л сульфата аммония и 1 мл/л раствора микроэлементов. (CaCl₂ • 2H₂O - 53 г/л, FeSO₄ • 7H₂O - 2 г/л, MnSO₄ • H₂O - 100 мг/л, ZnSO₄ • 7H₂O - 200 мг/л, CuSO₄ - 40 мг/л, CoCl₂ • 6H₂O - 60 мг/л, NaMoO₄ - 40 мг/л, H₃BO₃ - 30 мг/л), при этом pH доводят до 6,5 с помощью едкого натра. После выращивания в течение 12 ч культуры переносят в количестве 20% в перемешиваемые колбы емкостью 250 мл, содержащие по 25 мл посевной среды, но разные эфиры кетопрофена, которые прибавляют до получения конечной концентрации 10 г/л. Определяют скорость протекания процесса биотрансформации и энантиомерную чистоту выделяемого кетопрофена. Получены результаты, приведенные в табл.3.

Изобретение относится к разделению арилалкановых кислот. Для получения (S)-кетопрофена рацемическую смесь энантиомеров сложного эфира кетопрофена подвергают взаимодействию с микроорганизмом Trichosporen laibacchii. Процесс ведут при рН 4,5-7,5 и температуре 20-30^oC. Способ позволяет достигать селективности до 98%, при этом он прост, экономичен. 6 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения (S)-кетопрофена из рацемической смеси энантиомеров сложного эфира кетопрофена, отличающийся тем, что рацемическую смесь энантиомеров сложного эфира кетопрофена подвергают взаимодействию с микроорганизмом Trichosporon laibacchii. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют микроорганизм, характеризующийся способностью селективно превращать рацемическую смесь энантиомеров сложного эфира кетопрофена в (S)-кетопрофен. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве сложного эфира кетопрофена используют этиловый эфир. 4. Способ по п. 2 или 3, отличающийся тем, что в качестве сложного эфира кетопрофена используют метиловый эфир. 5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что используют микроорганизм штамма Trichosporon laibacchii IMICC 348917. 6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что процесс ведут при pH 4,5-7,5. 7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что процесс ведут при температуре 20-30^oC.