Способ получения S(+) энантиомера 2-арилпропионовой кислоты Советский патент 1993 года по МПК C12P41/00 C12P7/40 C12P41/00 C12R1/01 

Изобретение относится к синтезу биологически-активных соединений,проявляющих терапевтическую активность.

Более конкретно изобретение относится к способу получения S(+) энантиомера 2-арилпропионовой кислоты общей формулы

СН3 Аг-СН-СООН ,

(D

где Аг - свободный или 3-бензоилзамещен- ный фенил, который проявляет противовоспалительные свойства.

Известно получение S энантиомеров 2 -арилпропионовых кислот путем стерео- специфического гидролиза рацемических сложных эфиров посредством липазы внеклеточного или микробного происхождения

(европейский патент № А-227078). Однако, согласно этому способу получают целевой изомер с выходом 60%.

Цель изобретения заключается в повы- , шении выхода S(+) энантиомера кислоты формулы I и в.получёнии практически чистой оптически активной кислоты.

Это достигается тем, что рацемические 2-рилропинамиды гидролизуют посредством микроорганизмов или энзимов, выбранных в зависимости от их способности к селективному гидролизу рацемического а-фенилпропионамида в «-фенилпропионо- вую кислоту S,

Селекция агентов, позволяющих осуществлять знантиоселективный гидролиз рацемических 2-арилпропионамидов, осуществляется путем контактирования агента с рацемическим or-фенилпропионамидом в соответствующей среде до преобразования

00

О

о

N5 О

CJ

20% продукта с последующим измерением знантиомерного избытка. Отбираются агенты, которые гидролизуют, в этих условиях, рацемический о-фенилпропионамид в сс-фе- нилприпио новуго кислоту S с энантиомер- ным выходом, превышающим 65%.

Среди таких микроорганизмов можно назвать штаммы, принадлежащие к роду Brevlbacterlum или Corynebacterlum и, в частности, В rev bacterium R312 (CBS 717, 73) и Corynenacterium И 771 (PERM P 4445) или Corynebacterlum N2 774 (FVRM P 4446), которые позволяют получить 2-арилпропионо- вые кислоты S с энантиомерным избытком изомера S, превышающем 90%

Согласно изобретению, способ обычно осуществляется в однородной или неоднородной водной или водноорганической среде в определенных условиях температуры и рН в ззвисимости от вида микроорганизмов и энзима с перемешиванием суспензии клеток или клеточных экстрактов микроорганизма а рацемического 2-арилп- ропионамида..

Способ приводит к смеси 2-арилпропи- оновой кислоты S и 2-арилпропионамида R, причем 2-арилпропионамид R может ра- цемизироваться по известным технологиям в рацемический 2-арилпропионамид, который снова может гидролизоваться в 2-арилпропионовую кислоту SB приведенных условиях.

Например, рацемизация 2-арилпропионамида Р может осуществляться путем нагрева с гидратом окиси аммония при температуре от 80 до 160°С.

Способ согласно настоящему изобретению, особенно подходит для получения катбпрофена S/+/ из рацемического 2-/3/- бензоилфенил/ пропианамида.

Нижеприведенные неорганические примеры показывают возможность практического осуществления изобретения,

П р и м е р 1. а/Штамм Brevlbacterlum R 312/CBS 717,73/ культивируют в колбе при перемешивании при 20°С в течение 14 ч в среде со следующим составом: Глюкоза10 г (NH4)aS04 - 5 г КН.Р04 1,01 г . N32HP04, 12Н20 1,64 г К2НР04 0,82 г CaCla 2Н20 0,012 г ZnCl2 - - 0,0012 г FeSCM 7Н20 0,0012 г MnS04 H20 0,0012 г MgS04 7H20 0,5 г Хлоргидраттиамина 0,002 г

Вода в количестве

до 1000 ем .

Эту предварительную культуру используют для затравки культурной среды, имеющей тот же самый состав, но содержащий, кроме того, N-метилацетамид с концеитра- цией 20 мМ. Культивирование осуществляют в колбе с перемешиванием в течение 24 ч при 28°С. Полученную биомассу отделяют центрифугированием, затем промывают два раза раствором хлорида натрия при 9 г/л.

. П р и м е р 2. а/Культивируют в колбе с перемешиванием при 28°С в течение 14 ч штамм Corynebacterlum 771 (PERM P 4445) в среде со следующим составом: Дрожжевой экстрактЗг Солодовый экстракт 3, г Бактопептон .5 г Глюкоза 10 г FeS047H20 0,1 г Вода в количестве - до 1 л а)рН регулируют до 7,5 путем добавки едкого натра перед стерилизацией.

Эту предварительную культуру используют для затравки 1/40-й среды такого же . состава, в которую добавляют из расчета 5 см3 на 1 л, нитриловый раствор кетопро- фена в ацетонитриле (0,2 г/см3). .. ;, После инкубации в течение 24 ч при 20°С в перемешиваемой колбе отделяют бй- омассу центрифугированием, затем промы-. вают два раза водным раствором натрия при 9 г/л.

б) Осадок центрифугирования,содержащий72 мг клеток .Corynebacterlum i N2 771 в

расчете на сухое вещество, переводят в суспензию с 2 ем3 буферного фосфатного растеорителя (50мМ)при рН 7. Добавляют.2-5

мг рацемического 2-фенилпропион:амида (1 67 fi- моль); затем перемешивают в

течение 24 ч при 25°С, Реакционную смесь

обрабатывают в условиях по примеру 1.

Всплывшая часть содержит 110Ц моль 2-фенилпропионамида,1 34/г моль 2-фенилп- ропионовой кислоты-.- Содержание энантиомера 2-фенилпро- пионовой кислоты, измеренное по вращательной способности и после его отделения с помощью R/+/ «-метилбензиламина, измеренное по ЖХВВ составляет соответст- венно 100 и 95% изомера S/+/.

Приме р 3. Осадок центрифугирования, полученный в условиях по примеру 1 а), содержит 13 мг клеток В rev i bacterium R 312, в расчете на сухое вещество, переводят в суспензию с 2 см буферного фосфатного раствора (50 мМ) при рН 7. Добавляют 25 мг рацемического 2-фенилпропионамида (167/ моль). Перемешивают в течение 24 ч

при 25°С, Реакционную смесь обрабатывают в условиях по примеру 1.

Всплывшая часть содержит 95,2 I моль 2-фенилпропионамида; 56, 1 /г моль 2-фе- нилпропионовой кислоты.

Содержание энантиомера 2-фенилпро- пионовой кислоты, измеренное по вращательной способности и после отделения с помощью R/+/ а-метилбензиламина, измеренное по ЖХВВ составляет соответствен- но 99 и 95% изомера S/+/.

П р и м е р 4, Осадок центрифугирования, полученный в.условиях по примеру 1 а), содержащий 66 мг клеток Brevlbacterlum R 312, в расчете на сухое вещество, пере- водят в суспензию с 2 см3 буферного раствора фосфата калия (50 мМ) при рН 7. Добавляют 25,9 рацемического 2-(3-бензил- фенил)пропионамида (102 ц моль). Перемешивают 72 ч при 25°С. Реакционную смесь разбавляют путем добавления 23 см3 смеси ацетонитрил-хлористоводородная кислота N (90-10 объем). Бактерии удаляют центрифугированием. Всплывшая часть, проанализированная посредством жидкой хро- матографии с высоким выходом, содержит 46// моль кетопрофена; 59// моль амида кетопрофена.

Добавляют хлорид натрия для лучшего разделения водных и органических фаз. После выпаривания досуха органической фазы, осадок обрабатывают 20 см смеси хлороформ - едкий натр 0,1 N (1-1 объем).

Основную фазу подкисляют, затем экстрагируют хлороформом. После выделения кетопрофена с помощью Р/+/а-метилбен- зиламина, анализ посредством жидкой хро- матографии с высоким выходом смеси двух диастереоизомеров показывают, что содержание энантиомера S(+) кетопрофена составляет 93%.

П р им е р 5. Осадок, содержаа(ий 180 мг клеток Co rynebacterium № 771, полученный в условиях по примеру 2а), в расчете на сухое вещество, переводят в суспензию с 2 см3 буферного раствора фосфата калия (50 мМ) при рН 7. Добавляют 25,3 амида рацемического кетопрофена (100/4 моль). Перемешивают в течение 48 ч при 25°С, затем добавляют 23 см смеси ацетонитрил - хлористоводородная кислота N (90-10 объем).. Бактерии удаляют центрифугированием. Всплывшая часть, проанализированная посредством жидкой хроматографии, с высоким выходом, содержит 76,03# моль ами- да кетопрофена; 24,7/г моль кетопрофена.

Добавляют несколько мг хлорида натрия. Разделяют водную и органическую фазы. После выпаривания досуха органической фазы, осадок обрабатывают 20 см смеси хлороформ - едкий натр 0,1 N (1-1 объем). Водную фазу подкисляют, затем экстрагируют хлороформом. После выделения кетопрофена с помощью Я/+/а-ме- тилбензиламина, анализ, посредством ЖХВВ смеси двух диастероизомеров показывает, что содержание S(+) энантиомера кетопрофена составляет 94%.

П р и м е р 6. Клеточный осадок Corybacterlum № 774 (PERM P 4446) получают в условиях, описанных в примере 2 а), для получения клеточного осадка Corynebacterium №771.

Клеточный осадок, содержащий 176 мг клеток, в расчете на сухое вещество, переводят в суспензию с 2 см3 буферного раствора фосфата калия (50 мМ) при рН 7. Добавляют 25,3 мг рацемического амида кетопрофена (100/ моль). Перемешивают 48 ч при 25°С, затем обрабатывают реакционную смесь в условиях по примеру 1.

Анализ реакционной смеси показывает, что она содержит 78,6 /.I моль амида кетопрофена; 22, 4// моль кетопрофена.

Содержание энантиомера S(+) кетопрофена, определенное после выделения, составляет 95%

Пример. В автоклав объемом 5 см3, содержащий 1 см3 28%-ного гидрата окиси аммония, вводят 20 мг амида чистого, оптически активного кетопрофена (79 fi моль). После закрытия, автоклав помещают на 2 ч в печь с температурой 150°С, После охлаждения содержание автоклав вливают в 5 см3 воды. Добавляют рН до 1 путем добавки хлористоводородной кислоты 1 N. Водную фазу экстрагируют хлороформом. Хлороформную фазу высушивают на сульфате натрия. После фильтрования объем доводят до 2 см3 путем концентрирования.

Вращательная способность этого хлороформного раствора является нулевой.

Анализ посредством хроматограмм ЖХВВ показывает, что этот раствор содержит 72,2 fi моль амида кетопрофена и 4,1 // моль кетопрофена.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н ия

Способ получения S(+) энантиомера 2- арилпропионовой кислоты общей формулы

СИ3 Аг-СН-СООН ,

где Аг - свободный или 3-бензоилзамещен- ный фенил,

Путем анантиоселективного гидролиза функционального производного 2-арилпро

пионовой кислоты в присутствии фермен-соответствующий рацемический 2-арилпротопродуцирующего микроорганизма, от л и-пионамид, а в качестве ферментопродуцич а ю щ и и с я тем, что, с целью повышениярующего микроорганизма используют

выхода и оптической чистоты целевого про-Brevlbacterlum P 312 (CBS 71773),

дукта, в .качестве функционального произ-5 Corynebacterlum № 771 (PERM P 4445) или

водного 2-арилпропионовой кислоты берутCorynebacterium № 774 (PERM P 4446).

Использование: биотехнология, область синтеза биологически активных соединений. Сущность изобретения: рацемический 2-арилпропионамид подвергают стереоспе- цифическому гидролизу микроорганизмом, выбранным в зависимости от его способности к селеквиному гидролизу а-фенилпропи- онамида в а-фенилпропионовую кислоту S(+). Способ предусматривает получение смеси 2-арилпропионамид R рацемизирует- ся по известным технологиям в рецемиче- ский 2-арилпропионамид, который снова может гидролизоваться в 2-арилпропионо- вую кислоту S. Рацемизацию 2-арилпропио- намида осуществляют путем нагрева с гидратом окиси аммония при 80-160°С.