СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (S)-2-(3-БЕНЗОИЛФЕНИЛ)ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ СМЕСИ ЭНАНТИОМЕРОВ ЕЕ АЛКИЛЬНОГО ЭФИРА Российский патент 1999 года по МПК C12P41/00 C12P7/40 

Это изобретение относится к получению арилалкановой кислоты, в частности к получению 2-(3-бензоилфенил) пропионовой кислоты (кетопрофена).

2-Арилпропионовые кислоты хорошо известны в качестве противовоспалительных средств. Например ибупрофен, напроксен и кетопрофен. Эти соединения являются хиральными и S-энантиомеры обладают терапевтической активностью.

Известны несколько методов получения (S)-энантиомера, не загрязненного (R)- энантиомером. Они включают асимметрический химический синтез и химическое разделение, к которому относится например стехиометрическая кристаллизация диастереомерных солей, образованных с различными хиральными аминами.

Альтернативным подходом является биокаталитический, при котором для селективного гидролиза эфира 2- арилпропионовой кислоты используют биокатализатор.

При условии установления биокатализатора с упорядоченной пространственной структурой получают реакционную смесь, содержащую непрореагировавший сложный эфир одного энантиомера и кислотный продукт другого энантиомера. Дальнейшее разделение и извлечение продукта является относительно легким. Непрореагировавший сложный эфир рацемизируют и повторно используют в дальнейшей реакции, вследствие чего обеспечивается почти полное превращение рацемического субстрата в требуемый одиночный энантиомерный продукт.

EP-A-0227078 описывает использование при таких биокаталитических разделениях несколько внеклеточных, коммерчески пригодных микробных липаз для таких биокаталитических разделений. Однако при этом необходимы большие количества фермента, при продолжительности реакции 2-6 дней. Такие реакции являются дорогостоящими. Известно, что самым лучшим порошком фермента является порошок Candida cylindracea (известного как Candida rugosa); в ЕР-A-0407033 было показано, что такой препарат, имеющий также низкую активность, содержит более чем один фермент с эстеразной активностью. Кроме того, для того, чтобы получить кетопрофен с высоким энантиомерным избытком, необходимо очистить препарат.

ЕР-A-0233656 описывает выделение и клонирование эстеразного гена из Bacillus thai. Было показано, что этот фермент селективно гидролизует этиловый и метиловый эфиры как напроксена, так и ибупрофена до получения (S)-кислоты соответствующих соединений. Было также показано, что в результате сведения к минимуму других ферментных побочных активностей, клонирование фермента приводит к получению препарата, дающего продукт с более высоким энантиомерным избытком.

WO- A-9323547 описывает ряд штаммов, которые также продуцируют эстеразу, которая селективно гидролизует эфиры напроксена. Было найдено, что самым лучшим штаммом, из которого клонируют эстеразу, является Zopfiella latipes.

WO-A-9304189 описывает организм Trichosporon sp, который способен селективно гидролизовать (S)-энантиомер этилкетопрофена до получения (S)-кислотного продукта, имеющего энантиомерный избыток > 90%.

Фермент, который осуществляет это биопревращение, является внутриклеточным. Известно, что трудно повысить биокаталитическую активность посредством клонирования гена или классическим мутагенезом, и это приводит к трудностям при получении стабильных бесклеточных препаратов.

Задачей настоящего изобретения является получение биокатализатора, который обладает высокой активностью против различных кетопрофеновых эфиров, который позволяет получить кетопрофеновый кислотный продукт с высоким энантиомерным избытком, являющийся подходящим для клонирования и гиперэкспрессии, например E.coli, позволяющий сохранять стоимость биокатализатора минимальной.

Поставленная задача достигается при помощи аскомицета Ophiostoma novo-ulmi (также известного как Ceratocystic ulmi), продуцирующий внутриклеточный гидролитический фермент, который осуществляет желательную реакцию. Дополнительные опыты показывают, что в отличие от штамма, раскрытого в WO-A-9304189, достигается стабильная бесклеточная активность и что, следовательно, он является подходящим для клонирования и возможного использования в бесклеточных биопревращениях. Ophiostoma novo-ulmi представляет патагенный растительный организм, который является вирулентным возбудителем болезни Lutch Elma. Известно, что он тесно связан с менее вирулентными штаммами Ophiostoma ulmi, а также с O.piceae.

Было обнаружено, что стереоспецифическая эстеразная активность присутствует в альтернативных штаммах Ophiostoma novo-ulmi в Ophiostoma ulmi (известных как Ceratocystis piceae) и Ophiostoma piseae (известных как Ceratocystic piceae) и в культурах, собранных из различных мест в США, Европе, Среднем Востоке и Узбекистане. Кроме того, были получены и отобраны по активности альтернативные штаммы Ceratocystic sp., полученные от IMI, Эгхэма, Суррея, Великобритания.

Было обнаружено, что активность присутствует также в штаммах C.coronata (например, IMI 176533), S.ips (например, IМI 212114), C.tetropii (например, IMI 176523), и C.arborea (например, IMI 176529) и C.stenoceras (например, IMI 268494). Следовательно, активность широко распространена среди ряда альтернативных штаммов Cera-tocystis, собранных в различных местах мира.

Первоначально был отобран штамм A J3, зарегистрированный в IMI 15 февраля 1993 г. под добавочным номером IMI 356050 согласно условиям Будапештского договора. Хотя этот штамм является хорошим примером активности, не стоит ограничивать широко распространенную природу активности в большом множестве родственных штаммов, входящем в область изобретения, частным микроорганизмом. Это изобретение также распространяется на применение ферментативной активности, выделенной из таких микроорганизмов, посредством соответствующей методики.

В соответствии с настоящим изобретением микроорганизмы рода Ophiostoma с их ферментативной активностью используют для стереоселективного гидролиза рацемического алкилэфира кетопрофена до получения кислоты, в значительной степени обогащенной (S)-энантиомером, например до 93-96% энантиомерного избытка или более при степени превращения 15-25%, и оставшегося остаточного сложного эфира, обогащенного (R)-энантиомером. Реакцию осуществляют для любой смеси энантиомеров сложного эфира, хотя такая смесь обычно является рацемической. Алкильная группа эфира предпочтительно содержит от 1 до 3-х углеродных атомов.

Реакцию предпочтительно проводят при pH 8-11, более предпочтительно при pH 9,5-10,5, и наиболее предпочтительно при pH 10.

Обычно применяют органический растворитель, например циклогексан. Затем для отделения кислотного продукта от сложного эфира используют стандартные химические методики. Если необходимо, путем использования хирального амина, например (R) -α- метилбензиламина, можно улучшить оптическую чистоту кислоты. Оставшийся непревращенный эфир рацемизируют для дальнейшего применения.

Изобретение иллюстрируют последующие примеры.

Пример 1. БИОПРЕВРАЩЕНИЕ РАЦЕМИЧЕСКОГО ЭТИЛКЕТОПРОФЕНА ПРИ ПОМОЩИ AJ3.

Для культивирования микроорганизма используют следующую среду.

(NH₄)₂SO₄ (г/л) - 0.5
MgSO₂•7H₂O (г/л) - 0.25
CaCl₂•H₂O (г/л) - 0.1
KH₂PO₄ (г/л) - 8.0
Дрожжевой экстракт (г/л) - 10.0
Глюкоза (г/л) - 5.0
Раствор микроэлементов ( μ л/л) - 100
pH (установленный с помощью NaOH) - 6.5
Состав раствора микроэлементов:
CaCl₂•2H₂O (г/л) - 3.57
ZnO (г/л) - 2.0
CuCl₂•2H₂O (г/л) - 0.85
Na₂MoO₄•2H₂O (г/л) - 4.8
MnCl₂•4H₂O (г/л) - 2.0
FeCl₃•6H₂O (г/л) - 5.4
H₃BO₄ (г/л) - 0.3
CoCl₂•6H₂O (г/л) - 2.4
HCl (мл/л) - 250
Клетки AJ3 засевают с чашки агара с солодовым экстрактом в 30 мл питательной среды, находящейся в 250 мл мерной колбе, при непрерывном перемешивании в течение 30-ти часов при 23^oC. Затем 2.5 мл переносят во вторую 250 мл мерную колбу, содержащую 30 мл среды. Последующее культивирование осуществляют в течение 40 часов при температуре 23^oC и встряхивании, затем к бульону добавляют рацемический этилкетопрофен до концентрации 20 г/л. Биопревращение осуществляют в течение 120 часов, после проводят анализ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). При этом гидролиз добавленного эфира проходит на 18.2% и энантиомерный избыток образованной кетопрофеновой кислоты на 96% состоит из (S)-энантиомера.

Пример 2. ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЧЕСКОГО РАСТВОРИТЕЛЯ.

Готовят раствор неочищенного фермента, используя ту же самую питательную среду, что и в примере 1, за исключением глюкозы, при pH 6.0. Клетки AJ3 засевают в 100 мл среды, находящейся в 1 л качалочной колбе. Культивируют при непрерывном перемешивании при 30^oC в течение 48 часов. Затем 10 мл переносят в 90 мл свежей среды, помещенной в 1 л качалочную колбу, и культивируют в течение еще 8-ми часов при 30^oC со встряхиванием. Инокулят этой колбы помещают в 2.8 л лабораторный ферментер с 1.5 л среды, 5 г/л глюкозы и 0.5 мл/л силикона/противовспенивателя на основе PPG (полипропиленгликоля) (XF0371, lvanhoe Chemicals, III. , США). Ферментацию проводят в течение 48-ми часов при перемешивании и аэрации и регулировании насыщения воздуха для поддержания DOT > 50% при 30^oC и pH, равном 6.0.

По завершении ферментации клетки собирают путем центрифугирования и осадок повторно суспендируют при 10% вес-об. (относительно влажной массы клетки) в лизирующем буфере, т.е. 0.1М карбонате натрия в 5% водном растворе Т ritona Х-100. Лизис проводят всю ночь при 8^oC со встряхиванием, после чего лизат, имеющий ферментативную активность, отделят от остатков клеток посредством центрифугирования.

Рацемический этилкетопрофен растворяют в каждом из четырех органических растворителей: толуоле, циклогексане, метаноле и МТВЕ (метил-трет-бутиловом эфире) до концентрации 20 г/л.

2 мл каждого из этих растворов добавляют к 5 мл аликвотам раствора неочищенного фермента в стеклянных пробирках. Как контроль используют водное биопревращение, содержащее 5 мл раствора неочищенного фермента, 400 мк 50% рацемического этилкетопрофена, 0,5% вес./об. исходного раствора Tweena 80 и 2.5% вес/об. Tritona Х-100. Реакция проходит при встряхивании в течение 48 часов при 25^oC. Результаты анализа водной фазы каждой реакционной смеси представлены в таблице 1.

При этом биопревращение происходит до определенного предела в присутствии циклогексана или МТВЕ в качестве растворителей и полностью ингибируется при этих условиях толуолом.

Пример 3. ВЛИЯНИЕ АЛКИЛЬНОЙ ГРУППЫ.

Различные сложные эфиры рацемического кетопрофена растворяют в циклогексане до концентрации 20 г/л. Используемыми эфирами выбирают метиловый, этиловый, н-пропиловый, н-бутиловый, н-пентиловый, н- гексиловый. В случае метилового эфира, благодаря низкой растворимости эфира в циклогексане, получают суспензию.

К 5 мл аликвотам раствора неочищенного фермента в стеклянных пробирках добавляют 2 мл каждого из шести растворов эфира рацемического кетопрофена, приведенных выше. В стеклянной пробирке, содержащей 5 мл раствора неочищенного фермента, 200 мк 50% рацемического этилкетопрофена, 0.5% маточного раствора Tweena 80 и 2.5% вес./об. Tritona Х-100, получают также водное контрольное биопревращение.

Реакции осуществляют при встряхивании в течение 24-х часов при 25^oC. Результаты анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией водной фазы каждого биопревращения приведены в таблице 2.

Культуру AJ3 выращивают по следующей методике.

AJ3 инокулируют в 100 мл среды, как в примере 1, находящейся в 1 л мерной колбе. Последующее культивирование осуществляют в течение 48 часов при 25^oC при орбитальном встряхивании (300 оборотов в минуту, дуга качания 25 мм). 1 мл переносят в каждую из трех 1 л мерных колб, каждая из которых содержит 100 мл среды. Культивирование проводят в течение еще 48 часов при тех же условиях, полученный инокулят помещают в 750 л ферментер, содержащий 500 л среды.

Состав среды:
MgSO₄•7H₂O - 0.4 г/л
CaCl₂•2H₂О - 0.1 г/л
KH₂PO₄ - 8.0 г/л
Дрожжевой экстракт - 30.0 г/л
Раствор микроэлементов - 200 мкл/л (как в примере 1)
Противовспениватель (XFO-371) - 0.5 мл/л
pH (с NaOH) - 6.0
Среду стерилизуют перед добавлением 15 л 50% вес/об стерильного раствора глюкозы при 121^oC в течение 50 минут.

Контрольные условия следующие: температура - 25^oC, при добавлении фосфорной кислоты или гидроксида натрия, pH равен 6.0 и DOT насыщения воздуха посредством регулирования перемешивания и аэрации ≥ 50%.

Через 64 часа культивирования клетки обрабатывают in situ для того, чтобы убить их и способствовать лизису. Это осуществляют посредством снижения температуры до 15^oC и добавления гидроксида натрия для доведения pH до 10. После 50-ти минутной обработки pH бульона устанавливают равным 7 с помощью фосфорной кислоты и клетки убирают в центрифуге постоянного действия. Собранные клетки распределяют в различных контейнерах и хранят при -20^oC до тех пор, пока они потребуются.

Замороженные клетки размораживают и повторно суспендируют при 25% вес/об (относительно массы влажных клеток) в лизисном буфере, т.е. 0,3М Na₂CO₃, pH 10.5. Лизис проводят всю ночь при 4^oC при перемешивании, после чего лизат осветляют посредством центрифугирования для отделения остатков клеток от супернатанта. Раствор фермента (т.е. лизат, супернатант) проверяют на активность, используя стандартные условия биопревращения, т.е. 1 мл раствор фермента растворяют в 0.1M Na₂CO₃, pH 10.0, 40 мкл 50% рацемическом этилкетопрофене, 0,5% исходном растворе Tweena 80,2 5% вес/об. Tritone X-100. Биопревращения осуществляют в герметичной стеклянной пробирке объемом 20 мл при встряхивании в течение одного часа при 25^oC. Активность выражают в виде "единица/мл активности", где 1 единица (ед.) = 1 мг кетопрофеновой кислоты, продуцированной в час при 25^oC. Анализируемая активность лежит в диапазоне от 1 до 5 единиц/мл.

50% маточный раствор рацемического этилкетопрофена готовят следующим образом: 25 г рацемического этилкетопрофена и 0.25 г Tweena 80 добавляют к 10 мл дистиллированной воды, и эту смесь подвергают звуковой обработке в течение 5 минут (амплитуда 15 мкм цикл: 10 секунд работы/10-ти секундное выключение.

Затем объем доводят до 50 мл дистиллированной водой и исходный раствор автоклавируют для стерилизации и обеспечения более длительного срока хранения.

Характерная активность лизата является 1.5 ед/мл.

Пример 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Осветленный лизат (пример 4) концентрируют в 4-5 раз путем пропускания через ультрафильтрационную единицу Amicon ДС2 с половолоконными модулями фильтрующие частицы с молекулярной массой до 30000 для удаления дистиллированной воды до тех пор, пока его концентрация не достигнет 20 мM Na₂CO₃ и pH буфера A 9,2, при этом исходная активность сохраняется > 90%. Фермент, обладающий активностью, периодически загружали на предварительно уравновешенную анионообменную смолу QA52 (Pharmacia) в течение 1 часа при комнатной температуре при степени насыщения 7-10 ед. активности на мл влажного геля QA52.

Колонку с насыщенным гелем при линейной скорости потока 200 мм/ч и при 4^oC промывают буфером A в количестве, равном 10-ти объемам. Колонки с концентрацией от 0-0,5М NaCl собирают фракции, соответствующие 1/35 объема. Типичный профиль элюирования показан в таблице 3.

Фермент, обладающий активностью элюируют в диапазоне концентрации NaCl 0.12 - 0.18 М. Объединят фракции 7-10 включительно для получения:
степени извлечения фермента, обладающего активностью объединенных фракций = 63.5%.

степени извлечения белка объединенных фракций = 15.8%.

Объединенную активность концентрируют с использованием мембраны YM 30 в ячейке с перемешиванием для ультрафильтрации клеток (AMICON) без потерь активности и подвергают диализу для удаления буфера A до достижения проводимости 3.2-3.6 mS. Затем ее подвергают повторной хроматографии на смоле QA52, полученные результаты представлены в таблице 4.

При втором пропускании фермент, обладающий активностью, элюируют в диапазоне концентрации NaCl 0.2-0.25М.

Объединяют фракции 15-17 включительно. Объединенную пробу анализируют на активность и содержание белка.

Активность = 27.8 ед. мл^-1
Общая активность = 2599 ед.

Извлечение общей активности = 83.5%
Белок (с использованием буферного метода) = 1.34 мг•мл^-1
Общее содержание белка = 125 мг
Общее извлечение белка = 5.5%
Объединенные фракции затем подвергают очистке с использованием предварительно заполненной анионообменной смолы pharmacia MONO PHR 5/5.

Условия хроматографии:
Буфер с низким содержанием соли = 20 мМ Этаноламин-HCl pH 9.0
Буфер с высоким содержанием соли = 20 мМ Этаноламин-HCl + 0.3М NaCl pH 9.0
Скорость потока = 1 мл/мин.

Профиль градиента
Время - Концентрация NaCl
0-5 минут - : ОМ
5-7 минут - : 0-0.1М
7-20 минут - : 0.1-0.3М
20-22 минуты - : 0.3М
22-23 минуты - : 0.3-ОМ
23-25 минут - : ОМ
Объем пробы = 1 мл
Объем фракции = 1 мл
Объединенные фракции после 2-го пропускания через смолу QA52 концентрируют в 10 раз с использованием ультрафильтрационной мембраны фильтрующей частицы с молекулярной массой до 30000, и полученный концентрат обессоливают в буфер с низким содержанием соли. При осуществлении HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) используют Pharmacia G-25PD10 гель фильтрационную колонку. На колонку для проведения одного опыта загружают белок, в количество приблизительно 5 мг. Получили следующий профиль элюирования (Таблица 5).

Фракции 9 и 10 объединяют для получения 88,5% фермента общей активности, затем очищают, используя вытеснительную высокоэффективную жидкостную хроматографию.

Для этого применяют колонку Analgel-TSK G 3000 SWXL 30 см x 7,8 мм.

Для проведения хроматографии используют следующие условия:
Буфер - 0.1М К₂HPO₄+20 мМ Na₂EDTA (соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) pH 7.0
Скорость потока = 0.4 мл•мин^-1
Объем пробы = 200 мк
Объем фракции = 400 мк
Объединенные фракции после высокоэффективной жидкостной хроматографии, при которой использовали ионообменную смолу MONO P, концентрируют в 1.5 раза путем пропускания через ультрафильтрационную мембрану фильтрующую частицы с молекулярной массой до 10000.

Концентрированную пробу обессоливают в буфере, используемом при вытеснительной HPLC, применяя колонку pharmacia G 25 pd 10. В таблице 6 представлен следующий профиль элюирования.

Оценку молекулярной массы эстеразы AJ3 для рацемического этилкетопрофена осуществляют при помощи SDS-PAGE (электрофореза в геле полиакриламида - натрийдодецилсульфата).

Для сравнения молекулярной массы предварительно окрашенные стандартные индикаторы (BISC) молекулярной массы белка пропускают через предварительно подготовленный 12% гомогенный SDS-PAGE мини-гель (BDH) используют буфер Elec trograd Buffer TTS (BDH).

Электрофорез проводят при постоянном напряжении (200 V) и предельном токе (40 мА на гель) до тех пор, пока синий краситель полностью не пройдет через гель. Обнаружение белка осуществляется посредством окрашивания с помощью Coomassie Blue.

Полосу белка, соответствующую эстеразе, идентифицируют путем сравнения полосы в активной и неактивной пробах. Сравнение относительных расстояний миграции активного белка и белковых стандартов указало, что новый очищенный денатурированный белок имел молекулярную массу чуть больше чем 32500 Да индикатор.

Пример 6. ВЛИЯНИЕ pH НА ГИДРОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
Значение pH биопревращения испытывают, используя объединенный материал, описанный выше, хранившийся в течение 4-х месяцев при -20^oC. Аликвоту доводят до комнатной температуры и разбавляют в 10 раз дистиллированной водой (разбавленный раствор фермента). 1.1М буферные исходные растворы получают при следующих значениях pH, используя указанные соли (когда было необходимо, pH регулируют с использованием гидроксида натрия или соляной кислоты):
pH 6.0 : - NaH₂PO₄
pH 7.0 : - NaH₂PO₄
pH 8.0 : - NaH₂PO₄
pH 9.0 : - глицин - HCl
pH 10.0 : - глицин - HCl
pH 11.0 : - Na₂HPO₄
Реакции биопревращения проводят в стеклянных пробирках следующим образом:
1 мл разбавленного раствора фермента
100 мкл 1.1 М исходного буферного раствора
40 мкл 50% исходного раствора рацемического этилкетопрофена
2.5% вес/об Tritona Х-100.

Для биопревращения при pH 12.0 к реакционной смеси, имеющей pH 11, непосредственно добавляют 1 М раствор NaON до тех пор, пока не достигается нужное значение pH. Все биопревращения осуществляют дважды и реакции проводят в течение 1 часа со встряхиванием при 25^oC. Основные результаты реакций показаны в таблице 7. Максимальная активность наблюдается при pH 10.

Способ основан на использовании биокатализатора. Микроорганизм рода Ophiostoma или вещество, обладающее ферментативной активностью на его основе, используют в качестве стереоспецифического агента в реакции биопревращения для получения (S)-кетопрофена из смеси энантиомеров его алкильного эфира. Предпочтительно используют Ophiostoma novo-ulmi IMI 356050. Реакцию проводят при рН 8 - 11, предпочтительно 9,5 - 10,5. Технический результат заключается в повышении энантиомерного избытка получаемого вещества. 5 з.п. ф-лы, 7 табл.

1. Способ получения (S)-2-3-бензоилфенил)пропионовой кислоты из смеси энантиомеров алкильного эфира 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты с применением биокатализатора, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют микроорганизм рода Ophiostoma или вещество, имеющее ферментативную активность на основе этого микроорганизма. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биокатализатор представляет собой микроорганизм Ophiostoma novo-ulmiIMI 356050. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют энантиомерную смесь С₁-С₃ алкильного эфира 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты. 4. Способ по п.4, отличающийся тем, что используют энантиомерную смесь этилового эфира 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты. 5. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что реакцию проводят при pH 8 - 11. 6. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что реакцию проводят при pH 9,5 - 10,5.