СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАТОЗАЩИТНОГО СРЕДСТВА ИЗ ЦВЕТКОВ БАРХАТЦЕВ РАСПРОСТЕРТЫХ (TAGETES PATULA L.) Российский патент 2008 года по МПК A61K36/28 A61P1/16 B01D11/02 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения лекарственного препарата растительного происхождения, обладающего гепатозащитным действием.

В качестве аналогов были выбраны ряд препаратов из расторопши пятнистой: «Легален», «Карсил», «Силибор» [Количественное определение силибина и суммы флаволигнанов в плодах Silibum Marianum (L.). В.А.Куркин, Г.Г.Запесочная, Е.В.Авдеева и др. Раст. ресурсы - 1996. - Т.32, вып.3. - С.80-86], а также комбинированные сухие растительные экстракты: «Сибектан» - сумма, содержащая сухой экстракт пижмы, жом плодов расторопши, зверобоя и березы; «Гепатофальк планта» - экстракт расторопши, чистототела большого и турмерика яванского. Из листьев бархата амурского получают «Флакозид»; тыква является сырьем для известных суммарных препаратов «Тыквеол» и «Тыквэйнол» [Регистр лекарственных средств России. РЛС - Энциклопедия лекарств. - 9-е изд. перераб. и доп. Под ред. Г.Л.Вышковский. - М.: РЛС, 2002. - 1504 с.].

Наиболее близким аналогом и прототипом для заявляемого объекта является способ получения гепатозащитного средства из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L), заключающийся в экстракции (методом перколяции) высушенных цветков бархатцев распростертых 70%-ным этиловым спиртом без последующего удаления растворителя [Ю.К. Василенко и др. Гепатопротекторные свойства препаратов из бархатцев распростертых // Хим. Фармац. Журнал, 1990, т.24, с.53-56]. Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков, из которых особо следует отметить:

- использование гепатотоксичного растворителя - этилового спирта;

- метод перколяции требует много временных затрат и большой расход растворителя;

- недостаточно высокое содержание действующих веществ в целевом продукте за счет больших потерь в ходе экстракии.

В заявляемом объекте основным действующим веществом, отвечающим за фармакологический эффект, является комплекс полифенолов, представленный галловой, хлорогеновой и феруловой кислотами, а также рутином, робинином, гиперозидом, кверцетином, дигидрокверцетином и патулетином. Последний преобладает в сумме полифенолов.

Технической задачей является разработка способа получения, отличающегося простотой и экономичностью, использованием доступного сырья, технологией без применения токсичных растворителей и более высокой биологической активностью.

Предлагаемая задача достигается экстракцией высушенных цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) 70%-ным этанолом при трехкратном кипении в течении 1 часа и соотношении сырье:экстрагент 1:5. Выделение целевого продукта осуществляется последующим удалением растворителя в вакууме и сушкой образовавшегося порошка.

Данный способ обладает следующими преимуществами перед известным: экстракцию сырья следует проводить в экстракторе мацерационного типа, что обеспечивает меньший расход растворителя и энергии; полностью исключает использование токсических растворителей; характеризуется высоким выходом целевого продукта (до 35%).

Пример.

10 кг высушенных и измельченных цветков бархатцев распростертых загружают в экстрактор мацерационного типа плотным слоем, заливают 70%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:5 и экстрагируют при температуре кипения в течение 1 часа. Процесс повторяют трижды до полноты экстракции и выхода целевого продукта. Полученные извлечения объединяют, упаривают при температуре 60-70°С и сушат под вакуумом в особом режиме до получения сухого экстракта.

Сухой экстракт представляет собой темно-коричневую массу, со своеобразным запахом, плохо растворимую в воде, но хорошо растворимую в 96%-ном этиловом спирте.

Выход целевого продукта составляет 34,5-35,0%. Стандартизацию целевого продукта производят спектрофотометрически по содержанию в нем суммы флавоноидов, а также другим качественным показателям.

Оценка гепатозащитной активности сухого экстракта из цветков бархатцев проведена на модели острого тетрахлорметанового гепатоза при его лечебно-профилактическом введении в дозе 100 мг/кг. Экстракт в виде водной суспензии начинали вводить перорально за 7 дней до введения тетрахлорметана (CCl₄), а затем совместно с CCl₄. Животные получали вещества утром в одно и то же время, до кормления животных. В случае совместного введения веществ и CCl₄ вещества вводили за 1 час до введения гепатотоксина. Контролем служили животные, получавшие такой же объем растворителя. В качестве препарата сравнения использовали карсил в эквивалентной дозе 100 мг/кг, который также вводили в виде водной суспензии. Забой животных проводили путем декапитации через сутки после последнего введения CCl₄. Одновременно проводили забой интактных животных, голодавших в течение 12-14 часов. Оценку функционального состояния печени проводили по степени нормализации следующих показателей: активности аланинаминотрансферазы (АлАт) и щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови, содержанию общего билирубина, триглицеридов (ТРГ) в сыворотке крови и гликогена в печени.

Активность АлАт в сыворотке крови определяли по методу Reitman S. и Frankel S. [Колб В.Г. Справочник по клинической химии / Колб В.Г., Камышников B.C. - Минск: Беларусь, 1982. - 336 с.], используя стандартные наборы реактивов производства «LaChema». Активность фермента выражали в мккат/л.

Активность ЩФ в сыворотке крови определяли по методу Bessey O.A., Lowry O.H., Brock M.I. [Колб В.Г. Справочник по клинической химии / Колб В.Г., Камышников B.C. - Минск: Беларусь, 1982. - 336 с.], используя стандартные наборы реактивов производства «LaChema». Активность фермента выражали в мккат/л сыворотки, которые означают число микромолей 4-нитрофенола, высвобождаемого в 1 л сыворотки за 1 час при 37°С.

Для определения общего билирубина в сыворотке крови использовали метод Йендрашика [Колб В.Г. Справочник по клинической химии / Колб В.Г., Камышников B.C. - Минск: Беларусь, 1982. - 336 с.] с использованием стандартного набора реактивов «LaChema». Содержание общего и связанного билирубина выражали в мкмолях на 1 л сыворотки.

Содержание ТРГ в сыворотке (ммоль/л) определяли энзиматическим колориметрическим методом, основанным на гидролизе ТРГ липазой с образованием жирных кислот и эквимолярного количества глицерина. Глицерин при наличии АТФ, гексокиназы и глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Пероксидаза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в присутствии хлорфенола с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации ТРГ в пробе. Для определения ТРГ использовали стандартные наборы реактивов производства «ДДС».

Содержание гликогена в печени определяли по реакции с фенолом в кислой среде после щелочного гидролиза гликогена, содержащегося в навеске печени, и выражали в г/кг печени [Montgomery, R. Determination of glycogen / R.Montgomery // Arch. Biochem. Biophys. - 1957. - Vol.67, №2. - P.378].

У нелеченных (контроль) животных под влиянием CCl₄ развивался острый гепатоз, характеризующийся значительными нарушениями функционального состояния печени. Отмечалось достоверное повышение в крови активности АлАт по сравнению с интактным уровнем на 405%, повышение активности такого фермента, как ЩФ, локализующегося в каналикулярной мембране гепатоцитов на 410%, а также повышение содержания в крови общего билирубина на 56%. Кроме этого, у животных контрольной группы отмечался рост концентрации ТРГ в сыворотке крови на 56% и снижение запасов гликогена в печени на 54% по сравнению со здоровыми животными (см. таблицу).

Таким образом, исходя из выявленных изменений изученных биохимических показателей сыворотки крови и печени, можно заключить, что введение крысам CCl₄ приводило к тяжелому поражению печени, которое сопровождалось развитием синдромов цитолиза (рост активности АлАт) и холестаза (рост активности ЩФ с одновременным увеличением концентрации билирубина в крови), нарушением липидного обмена (увеличение уровня ТРГ) и ухудшением гликогенсинтетической функции печени.

Лечебно-профилактическое введение сухого экстракта из цветков бархатцев в дозе 100 мг/кг привело к достоверному снижению по сравнению с контрольными значениями активности АлАт на 20%, ЩФ на 31% и увеличению внутрипеченочных запасов гликогена на 117%. Уровни общего билирубина и ТРГ в сыворотке крови у данной группы животных достоверно не отличались от соответствующих значений у контрольных животных (см. таблицу).

При лечебно-профилактическом введении карсила в той же дозе (100 мг/кг) наблюдалось более выраженное уменьшение по отношению к нелеченным животным активности АлАт достоверно на 35%, но активность ЩФ снизилась примерно в той же степени, что и у крыс, получавших экстракт из бархатцев. Помимо этого, отмечалось достоверное уменьшение по сравнению с контролем концентрации ТРГ в крови на 38% и повышение содержания гликогена в печени на 183%, причем эти показатели достоверно не отличались от таковых животных, леченных экстрактом из бархатцев, и точно так же, как и в этой группе у крыс, леченных карсилом, концентрация билирубина осталась на уровне нелеченных животных.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что по эффективности гепатозащитного действия экстракт из цветков бархатцев распростертых по большинству изученных биохимических показателей сыворотки крови и печени не уступает классическому гепатопротекторному препарату карсилу и может быть рекомендован для создания на его базе эффективного лекарственного препарата для лечения и профилактики заболеваний печени токсической этиологии.

ТаблицаВлияние сухого экстракта из цветков бархатцев распростертых на биохимические показатели крови и печени на модели острого тетрахлорметанового гепатоза Интактные, n=8CCl₄-гепатоз, n=6Экстракт бархатцев, 100 мг/кг n=6Карсил, 100 мг/кг n=6АлАт сыворотки крови, мккат/л0,19±0,0130,96±0,0360,77±0,0380,49±0,058 Р_И<0,05Р_К<0,05Р_К<0,05 +405%-20%-35%   Р_Б<0,01ЩФ сыворотки крови, Е/л42,6±7,01217,6±7,91149,6±6,59155,4±13,62 Р_И<0,05Р_К<0,05Р_К<0,05 +410%-31%-28%   Р_Б>0,05Общий билирубин сыворотки крови, мкмоль/л8,1±0,6812,7±1,69,2±0,779,9±0,73 Р_И<0,057Р_К>0,05Р_К>0,05 +56% Р_Б>0,05ТРГ сыворотки крови, ммоль/л1,18±0,1591,85±0,2891,39±0,1671,14±0,064 Р_И<0,05Р_К>0,05Р_К<0,05 +56%Р_И>0,05-38%   Р_И>0,05   Р_Б>0,05Гликоген печени, г/кг26,6±0,404,19±1,269,1±0,8411,9±3,02 Р_И<0,05Р_К<0,05Р_К<0,05 -54%+117%+183%   Р_Б>0,05Примечание: Р_И - уровень достоверной разницы по отношению к интактным значениям; Р_К - уровень достоверной разницы по отношению к контрольным значениям; Р_Б - уровень достоверной разницы по отношению к группе животных, получавших экстракт бархатцев; n - количество животных в группе

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения гепатозащитного средства. Способ получения гепатопротекторного средства из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) путем экстракции этанолом при трехкратном кипении при определенных условиях с последующим удалением растворителя в вакууме и сушкой образовавшегося порошка. Способ позволяет получить гепатозащитное средство с повышенным выходом биологически активных веществ. 1 табл.

Способ получения гепатопротекторного средства из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) экстракцией этанолом, отличающийся тем, что экстракцию проводят 70%-ным этанолом при трехкратном кипении в течение 1 ч и соотношении сырье: экстрагент 1:5 с последующим удалением растворителя в вакууме и сушкой образовавшегося порошка.