СПОСОБ ВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, касается бактериологического исследования и может быть использовано для дифференциации и идентификации микобактерий туберкулеза.

Бактериологическое исследование необходимо для подтверждения результатов аллергического, серологического и патоморфологического методов диагностики туберкулеза. Выделение из патологического материала культур несвойственных им видов возбудителя туберкулеза или атипичных микобактерий предполагает их идентификацию и дифференциацию. Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза необходима для установления источника инфекции, что имеет значение при выборе противотуберкулезных мероприятий в очаге инфекции. В ветеринарной практике бактериологическое исследование патологического материала проводится при постановке диагноза на туберкулез у крупного рогатого скота при отсутствии у убитых и павших животных изменений, характерных для туберкулеза, или их нечеткой выраженности, а также при необходимости определения вида микобактерий.

Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза по культуральным свойствам, включающий обработку диагностического материала, посев на плотную питательную среду, инкубацию и учет результатов. Рост микобактерий туберкулеза бычьего вида чаще обнаруживают на 20-40-й, человеческого - на 20-30-й, птичьего - на 10-20-й день, атипичных микобактерий - в разные сроки. Для изучения культуральных свойств выросшие колонии микобактерий пересевают на различные питательные среды и культивируют их при температуре 20-25, 37-38, 45°С. Микобактерий туберкулеза бычьего вида в первых генерациях на яичных средах при температуре 37-38°С растут скудно, не растут на яичных средах при 22 и 45°С, на яичной среде с салицилатом натрия, на МПА и МПБ и не образуют пигмента. Микобактерии туберкулеза человеческого вида также не растут на яичных средах при 22 и 45°С, на яичной среде с салицилатом натрия, на МПА и МП и не образуют пигмента. Микобактерии туберкулеза птичьего вида растут на яичных средах при 37-38 и 45°С и на яичной среде с салицилатом натрия. Отмечается скудный рост на яичных средах при 22°С и на МПБ.

Культуры атипичных микобактерий растут на яичных средах при различных температурах /1/. Для дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого вида от микобактерий туберкулеза бычьего вида применяют ниациновый тест с цианистыми солями с культурой, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена без малахитовой зелени, что требует специального оснащения для работы с ядовитыми солями и приготовления дополнительно модифицированной среды Левенштейна-Йенсена. Для дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов пользуются реакцией восстановления нитратов и нитритов. Реакция восстановления нитратов позволяет дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитраредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых атипичных микобактерий /2/. Постановка нитраредуктазной реакции включает выращивание исследуемой культуры до массового накопления, причем чтение результатов проводится через 15-16 часов. Микобактерии бычьего типа можно дифференцировать от микобактерий человеческого вида посевом на среду с 2-тиофен-карбоксил-гидразидом (ТСН) /3/. Для дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого вида от микобактерий туберкулеза бычьего вида используют также комбинированную среду с ТСН и нитратом калия или натрия. Микобактерии туберкулеза человеческого вида в отличие от микобактерий туберкулеза бычьего вида растут на ТСН, а присутствие в среде нитрата позволяет определять нитратредуктазную активность, свойственную микобактериям туберкулеза человеческого типа, но не микобактериям туберкулеза бычьего и птичьего видов, с помощью реактива Грисса /4/, что обеспечивает одномоментность дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов и атипичных микобактерий.

Цель изобретения - повышение эффективности и упрощение способа дифференциации микобактерий туберкулеза.

Поставленная цель достигается способом, включающим предпосевную обработку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, причем посев осуществляют на питательную среду, содержащую L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, малахитовый зеленый, глицерин химически чистый, агар, желток сваренного вкрутую куриного яйца и воду дистиллированную при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин 4,0 г калий фосфорнокислый двузамещенный 0,5 г сернокислый магний 0,5 г лимонная кислота 2,0 г лимоннокислое аммиачное железо 0,05 г малахитовый зеленый 20,0 мл глицерин химический чистый 40,0 г агар 10,0 г желток сваренного вкрутую куриного яйца 250,0 г дистиллированная вода до 1000,0 мл,

а дифференциацию осуществляют по появлению или отсутствию роста с учетом временного фактора.

Способ осуществляется следующим образом.

Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливают 300,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 20,0 мл малахитового зеленого и 40,0 г глицерина химически чистого. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводят до 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливают рН=7,1-7,2 добавлением 1н. NaOH или 1н. НСl. Свежие куриные яйца хорошо промывают в проточной воде, отваривают вкрутую, извлекают желтки. Расчетное количество сваренного вкрутую желтка (250 г) растирают в ступке в полученном солевом растворе до получения однородной массы, в которую добавляют 10,0 г агара, перемешивают, доводят объем до 1000 мл и нагревают на водяной бане до расплавления агара. Полученную среду автоклавируют в течение 30 минут при температуре 120°С и 1 атм. Приготовленную питательную среду разливают по пробиркам (30 мл) и скашивают. Диагностический материал обрабатывают по методу Аликаевой 3-6%-ным раствором серной кислоты, высевают на плотную питательную среду и инкубируют при температуре 37°С. Дифференциацию микобактерий туберкулеза бычьего и птичьего видов от атипичных микобактерий осуществляют по появлению роста через 1-2 недели, а микобактерий туберкулеза человеческого вида по отсутствию роста через 10 недель культивирования.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Проводили дифференциацию микобактерий туберкулеза в пробах патологического материала от обследуемых и больных туберкулезом (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, отделяемое верхних дыхательных путей) предлагаемым способом по сравнению с известными с подтверждением полученных результатов анализом жирнокислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, появление роста на среде в соответствии с изобретением через 1 неделю культивирования характеризовало атипичные микобактерии (M.gordonae и M.fortuitum), через 4 недели - микобактерии туберкулеза птичьего вида, а отсутствие роста через 10 недель - микобактерии туберкулеза человеческого вида, что подтвердилось результатами газожидкостной хроматографии.

Таблица 1 Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза Вид микобактерий Сроки выращивания, недель Среда выращивания Тесты Левенштейна Йенсена Финн-2 Попелеску в соответствии с изобретением ПО HP ГЖХ M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п + M.tuber. M.tuberculosis 10 + + + - б/п 4- M.tuber. M.gordonae 1 + + + + оранж. - M.gord. M.gordonae 1 + + + + оранж. - M.gord. M.gordonae 1 + + + + оранж. - M.gord. M.gordonae 1 + + + + оранж. - M.gord. M.fortuitum 1 + + + + б/п + M.fort. M.fortuitum 1 + + + + б/п + M.fort. M.fortuitum 1 + + + + б/п + M.fort. M.fortuitum 1 + + + + б/п + M.fort. M.avium 4 + + + + б/п - M.avium Примечание: ПО - пигментообразование, НР - нитратредуктазная реакция, ГЖХ - газожидкостная хроматография

Пример 2. Проводили дифференциацию микобактерий туберкулеза в пробах патологического материала (подчелюстные, заглоточные, брыжеечные лимфатические узлы, участки тощей и подвздошной кишок, печень и селезенка) от павших и убитых животных с изменениями, характерными для туберкулеза, и референс-штаммов микобактерий туберкулеза предлагаемым способом по сравнению с известными с подтверждением полученных результатов анализом жирноклслотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2 Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза в пробах патологического материала от павших и убитых животных Вид микобактерий Происхождение штамма Сроки выращивания, недель Среда Тесты Левенштейна Йенсена Финн-2 в соответствии с изобретением ГЖХ M.avium ГИСК 3 + + + M.avium M.avium ГИСК 3 + + + M.avium M.avium ГИСК 3 + + + M.avium M.tuberculosis (Academia) ГИСК 10 + + - M.tuber. M.tuberculosis (Н₃₇R_Y) ГИСК 10 + + ± M.tuber. M.tuberculosis (Н₃₇R_а) ГИСК 10 + + ± M.tuber. M.bovis (Vallee) ГИСК 3 + + + M.bovis M.bovis (Ravenall) ГИСК 3 + + + M.bovis M.bovis (BCG) ГИСК 3 + + + M.bovis M.bovis (N2) лимфатический узел коровы, Московская обл. 3 + + + M.bovis M.bovis(N3) лимфатический узел коровы, Московская обл. 3 + + + M.bovis M.vaccae (N296) лимфатический узел коровы, Якутск 1 + + + M.vaccae M.vaccae (N1896) лимфатический узел коровы, Якутск 1 + + + M.vaccae M.phlei ГИСК 1 + + + M.phlei M.flavescens ГИСК 1 + + + M.flavesc. M.smegmatis ГИСК 1 + + + M.smegm. M.peregrinum ГИСК 2 + + + M.peregr. M.gordonae ГИСК 2 + + + M.tuber. M.scrofulaccum ГИСК 2 + + + M.scroful. Примечание: ГЖХ - газожидкостная хроматография

Как видно из таблицы 2, появление роста на среде в соответствии с изобретением через 1-2 неделю культивирования характеризовало атипичные микобактерии (M.vaccae, M.phlei, M.flavescens, M.smegmatis, M.peregrinum, M.gordonae и M.scrofulaccum), через 3 недели - микобактери туберкулеза птичьего и бычьего видов, отсутствие роста или слабый рост через 10 недель - микобактерии туберкулеза человеческого вида, что подтвердилось результатами газожидкостной хроматографии. Возможность дифференциации микобактерий туберкулеза бычьего вида от микобактерий туберкулеза человеческого вида заявленным способом была подтверждена результатами культивирования микобактерий туберкулеза на среде с салицилатом натрия (росли микобактерии туберкулеза бычьего вида и не росли микобактерии туберкулеза человеческого вида) и ТСН (росли микобактерии туберкулеза человеческого вида и не росли микобактерии туберкулеза бычьего вида) и результатами газожидкостной хроматографии (таблица 3).

Таблица 3 Дифференциация микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов Вид микобактерий Происхождение штамма Способ дифференциации Тесты выращивание на среде с салицилатом натрия выращивание на среде с ТСН Выращивание на среде в соответствии с изобретением ГЖХ М.tuberculo-sis(Academia) ГИСК - + - M.tuberculosis М.tuberculosisH₃₇R_v ГИСК - + ± M.tuberculosis M.tuberculosis Н₃₇R_а ГИСК - + ± M.tuberculosis M.bovis (Vallee) ГИСК + - + M.bovis M.bovis (Ravenall) ГИСК + - + M.bovis M.bovis (BCG) ГИСК + - + M.bovis M.bovis (N2) лимфатический узел коровы, Московская обл. + - + M.bovis M.bovis (N3) лимфатический узел коровы, Московская обл. + - + M.bovis Примечание: ГЖХ - газожидкостная хроматография

Результаты проведенных исследований показали полное совпадение результатов биохимических и газохроматографических исследований, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением. Заявляемый способ дифференциации микобактерий туберкулеза по появлению или отсутствию роста на среде, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, малахитовый зеленый, глицерин химически чистый, агар, желток сваренного вкрутую куриного яйца и воду дистиллированную, с учетом временного фактора обладает значительной разрешающей способностью при простоте осуществления.

Источники информации

1. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. - Агропромиздат, 1991. - С.122-123.

2. Virtanen S.A. Study of nitrate reduction by mycobacteria. Acta Tuberc. Sc. 1960, v.48, P.1-119.

3. The biology of the Mycobacteria / Vol.1, Academic press, 1982, 544 р.

4. Патент РФ №2102483 С1, 20.01.1998.

Сущность способа заключается в том, что осуществляют посев предварительно обработанного диагностического материала на питательную среду, содержащую калий фосфорнокислый двузамещенный 0,5 г, сернокислый магний 0,5 г, L-аспарагин 4,0 г, глицерин химически чистый 40,0 г, малахитовый зеленый 20,0 мл, лимонную кислоту 2,0 г, лимоннокислое аммиачное железо 0,05 г, агар 10,0 г, желток сваренного вкрутую куриного яйца 250,0 г и дистиллированную воду до 1000 мл. Дифференциацию атипичных микобактерий от микобактерий туберкулеза проводят по появлению роста после 1-2 недель культивирования, а дифференциацию микобактерий туберкулеза птичьего и бычьего вида от микобактерий человеческого вида после 3-х недель культивирования. При отсутствии роста в течение 10 недель культивирования или наличии слабого роста определяют наличие микобактерий туберкулеза человеческого типа, для дифференциации которых от микобактерий туберкулеза бычьего типа проводят дополнительное культивирование на среде с салицилатом натрия и среде ТСН и газожидкостную хроматографию. Использование способа обеспечивает упрощение способа при повышении эффективности дифференциации. 3 табл.

Способ видовой дифференциации микобактерий туберкулеза, включающий предпосевную обработку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, культивирование и регистрацию результатов, отличающийся тем, что посев осуществляют на питательную среду, содержащую калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин химически чистый, малахитовый зеленый, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, агар, желток сваренного вкрутую куриного яйца и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:
фосфорнокислый калий двузамещенный 0,5 г сернокислый магний 0,5 г L-аспарагин 4,0 г глицерин химически чистый 40,0 г малахитовый зеленый 20,0 мл лимонная кислота 2,0 г лимоннокислое аммиачное железо 0,05 г агар 10,0 г желток сваренного вкрутую куриного яйца 250,0 г дистиллированная вода до 1000,0 мл,

дифференциацию атипичных микобактерий от микобактерий туберкулеза проводят по появлению роста после 1-2 недель, микобактерий туберкулеза бычьего вида и микобактерий туберкулеза птичьего вида от микобактерий туберкулеза человеческого вида - после 3 недель культивирования.