ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, касается питательной среды для выделения из патологического материала и культивирования микобактерий и может быть использовано в бактериологической диагностике туберкулеза.

Бактериологический метод, в частности посев биологического материала на специальные питательные среды, позволяет не только получать чистую культуру микобактерий, но и проводить их идентификацию, определять вирулентность, биологические и биохимические свойства.

В бактериологической практике наиболее часто используются плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, Финн-2 и ФАСТ-3Л /1/, обеспечивающие сравнимые показатели скорости и интенсивности роста, а также высеваемости микобактерий из патологического материала.

В качестве предпочтительного аналога нами рассматривается яичная среда Левенштейна-Йенсена, содержащая питательную основу из яиц, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимоннокислый магний, L-аспарагин, глицерин химически чистый, малахитовый зеленый и воду дистиллированную. Среда Левенштейна-Йенсена обеспечивает наилучшие результаты культивирования бычьего и человеческого видов микобактерий /2/.

Цель изобретения - повышение скорости роста и частоты индикации микобактерий из биологического материала.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая питательную основу из яиц, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимоннокислое аммиачное железо, L-аспарагин, глицерин химически чистый, малахитовый зеленый и воду дистиллированную, дополнительно содержит лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, гумивит и агар, а в качестве питательной основы из яиц - водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:

двузамещенный фосфорнокислый калий0,5 гсернокислый магний0,5 гL-аспарагин4,0 гглицерин химически чистый40,0 гмалахитовый зеленый20,0 мллимонная кислота2,0 глимоннокислое аммиачное железо0,05 ггумивит90,0-95,0 млагар30,0 гводный раствор желтка куриного яйца250,0 млдистиллированная водадо 1000,0 мл

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /3/. Раствор солей гуминовых кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /4, 5/. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 20,0 мл малахитового зеленего, 40,0 г глицерина химически чистого, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН=7,1-7,2 добавлением 1н NaOH или 1н HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, протирали 96° этиловым спиртом, разбивали в стерильных условиях и отделяли белок от желтка. В стерильной колбе смешивали желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 250,0 мл полученного раствора добавляли в расплавленную агаровую среду, перемешивали, разливали по пробиркам по 3 мл и скашивали.

Пример 2. Для сравнительного изучения информативности четырех вариантов среды в соответствии с изобретением, различавшихся содержанием гумивита, и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee, Ravenal БЦЖ), M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК и 659), M.smegmatis (шт.4), M.fortuitum и биологический материал от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Биологический материал предварительно обрабатывали по методу А.П.Аликаевой. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ, при посеве на известные среды и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры M.bovis (urr.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1.Скорость роста микобактерий разных видов на плотных питательных средахПитательная средаСкорость роста, сут.М.bovis шт ValleeМ.bovis шт.RavenalМ.bovis шт.БЦЖМ.tuberculosis шт.AcademiaМ.avium шт.ГИСКМ.avium шт.659М.smegmatis шт.4М.fortuitumБиоматериал от крупного рогатого скотаЛевенштейна-Йенсена13-1514-1616-1713-1510-1211-133-46-729-33Финн-213-1514-1616-1713-1510-1111-123-45-829-33Гельберга17-1917-1920-2117-1911-1213-132-3733-37ФАСТ-3Л16-1816-1818-1915-1710113630-34Петраньяни19-2119-2119-2116-1810-1211-134-59-1036-40Заявленная среда с содержанием гумивита, мл  ч      вариант 1 - 85,014-1617-1920-2117-1912-1413-154-51135-39вариант 2 - 90,011-1214-1616-1713-1510-1110-112626-28вариант 3 - 95,011-1212-1416-1712-1310-1110-112526-28вариант 4 - 100,011-1212-1416-1712-1310-1110-112526-28

Таблица 2.Интенсивность роста М.bovis (шт.Vallee) на плотных питательных средахПитательная средаСутки791011121314151624Левенштейна-Йенсена-----+++++++++Финн-2-----+++++++++Гельберга------+++++++++ФАСТ-3Л------+++++++++Петраньяни--==--+++++++++Заявленная среда с содержанием гумивита, мл
вариант 1 - 85,0          вариант 2 - 90,0----++++++++++++++вариант 3 - 95,0---+++++++++++++++++вариант 4 - 100,0---+++++++++++++++++Примечание: + - единичные колонии; ++ - 10-20 колоний: +++ - 21-50 колоний; ++++ - сплошной рост

По скорости первичного роста чистых культур на плотных питательных средах наилучшие показатели наблюдали на заявленной среде с содержанием гумивита 90,0-100,0 мл (таблица 1). Учитывая то, что увеличение количества гумивита выше 95,0 мл (вариант 4) не влияло на скорость роста, для практического применения рекомендованы варианты 2 и 3 с содержанием гумивита 90,0 и 95,0 мл соответственно. Культура М.bovis на средах Левенштейна-Йенсена, Гельберга и в соответствии с изобретением росла в виде отдельных, мелких, гладких, шаровидных, цвета слоновой кости колоний; на Финн-2, ФАСТ-3Л и Петраньяни - чаще в виде сухих морщинистых колоний. М.tuberculosis на этих же средах чаще всего росла в виде мелких, узелковоподобных, морщинистых, сухих, цвета слоновой кости колоний, a M.avium, M.fortuitum и М.smegmatis - в виде мягких, слизистых, серовато-белых колоний. На среде ФАСТ-3Л культура M.avium росла скудно - единичные колонии. По показателю интенсивности роста культуры М. bovis наиболее информативной оказалась среда в соответствии с изобретением (варианты 2-4), на которой интенсивный рост культур (++) проявлялся на 12-е, значительное накопление бактериальной массы - на 15-е, а сплошной рост колоний - на 24-е сутки (таблица 2). Интенсивность роста культуры микобактерий была значительно ниже на средах Гельберга, ФАСТ-3Л и Петраньяни.

Пример 3. Для определения высеваемости микобактерий исследовали 12 проб биоматериала от крупного рогатого скота с характерными поражениями внутренних органов и лимфатических узлов. При посевах готовили общую однородную пробу, смешивая и тщательно гомогенизируя все 12 отдельных проб. После обработки материала по методу Аликаевой пробы высевали на 40 пробирок каждой среды - Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л, Петраньяни, в соответствии с изобретением (с содержанием гумивита 95,0 мл). Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3.Высеваемость культур микобактерий из биоматериала от крупного рогатого скота на разных питательных средахПитательная средаЧисло посевов, пробиркиРост культурПророст посторонней микрофлорыпробирки%пробирки%Левенштейна-Йенсена40235725Финн-240225412Гельберга401127,537,5ФАСТ-3Л401127,5410,0Петраньяни40512,5512,5в соответствии с изобретением40307312

По показателю высеваемости микобактерий из биоматериала от животных наиболее информативными были среды в соответствии с изобретением, Левенштейна-Йенсена и Финн-2 - 73, 57 и 54% соответственно (таблица 3). Наименьший пророст посторонней микрофлоры наблюдали на средах в соответствии с изобретением и Финн-2 - 2%. Высеваемость микобактерий на остальных средах была в 2-4 раза ниже.

Основные характеристики известных твердых питательных сред и среды в соответствии с изобретением, подтвержденные результатами исследований:

Левенштейна-Йенсена - стандартная унифицированная, промышленного производства, доводка в условиях бактериологических лабораторий. Характер роста культур соответствует морфологическим свойствам разных видов микобактерий;

Гельберга - качество среды зависит от квалификации и опыта специалиста, часто принимает бледно-салатный цвет, что затрудняет просмотр колоний. Рост соответствует основным классическим характеристикам культур микобактерий;

Финн-2 - в состав входит дефицитный и дорогостоящий гликокол, по высеваемости и скорости роста при первичной индикации микобактерий сравнима со средой Левенштейна-Йенсена;

Петраньяни - по информативности, скорости и интенсивности роста микобактерий уступает всем остальным средам, но позволяет выявлять микобактерии из объектов внешней среды из-за способности длительно удерживать уровень рН 7,0;

ФАСТ-3Л - стандартная, промышленного производства, по ростовым свойствам не уступает среде Гельберга. Культуры, выросшие на ней, не дают роста при пересеве на другие питательные среды;

в соответствии с изобретением - технологична в приготовлении, по информативности, скорости и интенсивности роста и высеваемости микобактерий превосходит испытанные среды, включая Левенштейна-Йенсена. Высоко результативна для накопления биомассы первичных культур микобактерий. Характер роста культур соответствует морфологическим свойствам разных видов микобактерий. Интенсивно коричневый цвет среды позволяет обнаружить мелкие колонии в начальной стадии роста.

Источники информации, принятые во внимание:

1. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. - М.: Агропромиздат, 1991. - С.120-121.

2. RU 2268298 С1, 20.01.2006.

3. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит // Практик. - 2004. - № 3-4. - С.80-82.

4. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Макаров С.Е., 1999. - 198 с.

5. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в бактериологической диагностике туберкулеза. Питательная среда содержит в качестве питательной основы водный раствор желтка куриного яйца, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, малахитовый зеленый, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, гумивит, агар и дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить скорость роста микобактерий туберкулеза и увеличить чистоту их индикации из биологического материала. 3 табл.

Питательная среда для выделения из биологического материала и культивирования микобактерий, содержащая питательную основу из яиц, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, малахитовый зеленый и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, гумивит и агар, а в качестве питательной основы она содержит водный раствор желтка куриного яйца при следующем соотношении компонентов:

калий фосфорнокислый двузамещенный0,5 гсернокислый магний0,5 гL-аспарагин4,0 гглицерин40,0 гмалахитовый зеленый20,0 мллимонная кислота2,0 глимоннокислое аммиачное железо0,05 ггумивит90,0-95,0 млагар30,0 гводный раствор желтка куриного яйца250,0 млдистиллированная водадо 1000,0 мл