СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к бактериологической диагностике туберкулеза, в частности к питательным средам для культивирования микобактерий туберкулеза, выделенных из биоматериала животных.

Известна питательная среда Финн (авт. св. 325879, кл. С 12 N 1/20 от 1970 г. ) для выращивания микобактерий туберкулеза, ускоряющая рост и повышающая высеваемость микобактерий, содержащая диетические яйца - 4-5 штук; магнезию сернокислую 0,04-0,05 г; натрий лимоннокислый 0,10-0,12 г; железоаммиачные квасцы 0,004-0,005 г; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6-2,5 г; аммоний лимоннокислый однозамещенный 0,45-0,55 г; натрий глутаминовокислый однозамещенный 0,9-1,1 г; глицерин 1,6-2,5 мл; дистиллированную воду 100 мл; 2%-ный водный раствор малахитовой зелени 3,33-4 мл. Однако, при использовании этой питательной среды, рост первичных культур микобактерий очень медленный и появляется при посеве биоматериала через 30-70 дней, а при посеве чистых культур - через 21-50 дней (Ходун Л.М. и др. Питательная среда для выделения из биоматериала животных и культивирования микобактерий туберкулеза).

Известна питательная среда Фаст-3Л (патент РФ 2059728, кл. С 12 Q 1/04 от 1993 г.) для выделения из биоматериала животных и культивирования микобактерий туберкулеза. Состав среды, г/л: яйца куриные 400,0-500,0; желтки куриных яиц 90,0-100,0; молоко 140-160,0; картофельный отвар 140,0-160,0; малахитовый зеленый 0,2-0,25; солевой раствор:
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,14-0,16
Натрий лимоннокислый - 0,14-0,16
Магний сернокислый - 0,14-0,16
Пептон - 0,8-1,0
Глицерин - 3,2-4,0
Дистиллированная вода, мл - До 140-160
Алкан - 15,3-30,6
При посеве биоматериала от лабораторных животных и крупного рогатого скота на эту среду, первичный рост появляется на 17-19 сутки, однако, эта среда требует большого количества компонентов и быстро подсыхает в термостате.

Сущность изобретения заключается в том, что известная питательная среда, включающая куриные яйца, глицерин и малахитовый зеленый, согласно изобретению, содержит вытяжку древесной золы и оксидат торфа при следующем соотношении компонентов:
Яйца куриные, шт - 4-5
2%-ный водный раствор малахитовой зелени, мл - 3,33-4
1,5%-ная вытяжка древесной золы, мл - 100
Глицерин, мл - 1,6-2,5
Оксидат торфа, мл - 0,1
Приготовление среды: 4 куриных яйца моют щеткой с мылом и обрабатывают спиртом. Стерильным пинцетом разбивают яйца и выливают в стерильную колбу с бусами. Колбу встряхивают несколько минут после добавления каждого яйца до образования однородной массы. Добавляют 3 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 100 мл вытяжки древесной золы. Фильтруют через марлевый фильтр и свертывают при температуре 85^oС в течение 30 мин, предварительно разливая по 4-5 мл среды в пробирки.

Суспензии 30 культур M.bovis, выделенных от больного крупного рогатого скота и выращенных на среде Финн, стандартизируют по стандарту мутности: 500 млн кл/мл, засевают по 0,2 мл на испытуемую среду и контрольную (среда Финн). Посевы инкубируют при температуре +37^oС, просматривают ежедневно и учитывают результаты по срокам появления колоний и обильного роста.

На опытную и контрольную среды делают посевы из суспензии биоматериала, полученного от морских свинок, зараженных микобактериями бовинного вида (40 голов), а также от больного туберкулезом крупного рогатого скота (10 голов). У всех лабораторных животных и коров при вскрытии обнаружены поражения, характерные для туберкулеза, во внутренних органах и лимфатических узлах.

Подготовка к посеву. Кусочки органов (печень, селезенка, легкие, лимфатические узлы) измельчают, растирают в ступке пестиком со стерильным песком, заливают 6%-ньтм раствором щавелевой кислоты в соотношении: 1 часть биоматериала и 6 частей раствора кислоты, выдерживают 30 минут и центрифугируют при 3500 об в мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок промывают физиологическим раствором до рН 7-7,2. Промытый осадок засевают петлей на опытные и контрольные среды. Наблюдение за посевами проводят ежедневно до появления первичного роста, а затем - 1 раз в неделю до появления обильного роста.

Пример 1. Среду готовят следующим образом.

Предварительно готовят вытяжку древесной золы. Берут 0,5 г золы, просеянной через сито, и доливают до 100 мл дистиллированной водой, выдерживают 1 сутки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин.

Посев суспензии из M.bovis и биоматериала от морских свинок, зараженных туберкулезом, и крупного рогатого скота с изменениями в лимфоузлах, проводились как указано выше.

Учет результатов показал, что на среде Финн колонии появились на 8 сутки, обильный рост - на 16 сутки, на испытуемой среде колонии появились на 12 сутки, а обильный - на 18 сутки.

Пример 2. Готовят среду в соответствии с примером 1, но древесную золу выдерживают 2 суток.

Пример 3. Готовят среду в соответствии с примером 1, но древесную золу выдерживают 3 суток.

Пример 4. Готовят среду в соответствии с примером 1, но древесную золу выдерживают 4 суток. Состав древесной вытяжки как в примере 3.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1, 2, 3 и 4, при выращивании микобактерий из эталонных штаммов и свежевыделенных культур из биологического материала от больных туберкулезом животных, представлены в таблице 1.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Предварительно готовят вытяжку древесной золы: к 1,5 г сухой золы доливают дистиллированную воду до 100 мл, выдерживают 1 сутки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм в течение 30 мин.

Пример 6. Среду готовят в соответствии с примером 5, но выдерживают вытяжку золы 2 суток.

Пример 7. Среду готовят в соответствии с примером 5, но вытяжку выдерживают 3 суток.

Пример 8. Среду готовят в соответствии с примером 5, но вытяжку древесной золы выдерживают 4 суток.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 5, 6, 7 и 8, представлены в таблице 2.

Пример 9. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Предварительно готовят вытяжку древесной золы: 3 г сухой золы доливают дистиллированной водой до 100 мл, выдерживают 1 сутки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм в течение 30 мин.

Пример 10. Среду готовят в соответствии с примером 9, но выдерживают вытяжку золы 2 суток.

Пример 11. Среду готовят в соответствии с примером 9, но выдерживают вытяжку золы 3 суток.

Пример 12. Среду готовят в соответствии с примером 9, но выдерживают вытяжку золы 4 суток.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 9, 10, 11 и 12, представлены в таблице 3.

Пример 13. Готовят среду в соответствии с примером 5, но вносят дополнительно оксидат торфа в количестве 0,5 г/л.

Пример 14. Готовят среду в соответствии с примером 5, но вносят дополнительно оксидат торфа в количестве 1 г/л.

Пример 15. Готовят среду в соответствии с примером 5, но вносят дополнительно оксидат торфа в количестве 1,5 г/л.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 9, 10 и 11, представлены в таблице 4.

Пример 16. Готовят среду в соответствии с примером 6, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 0,5 г/л.

Пример 17. Готовят среду в соответствии с примером 6, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 1 г/л.

Пример 18. Готовят среду в соответствии с примером 6, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 1,5 г/л.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 16, 17 и 18, представлены в таблице 5.

Пример 19. Готовят среду в соответствии с примером 7, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 0,5 г/л.

Пример 20. Готовят среду в соответствии с примером 7, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 1 г/л.

Пример 21. Готовят среду в соответствии с примером 7, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 1,5 г/л.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 19, 20 и 21, представлены в таблице 6.

Пример 22. Готовят среду в соответствии с примером 8, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 0,5 г/л.

Пример 23. Готовят среду в соответствии с примером 8, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 1 г/л.

Пример 24. Готовят среду в соответствии с примером 8, но дополнительно вносят оксидат торфа в количестве 1,5 г/л.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 22, 23 и 24, представлены в таблице 7.

Таким образом, предлагаемая питательная среда, за счет добавления минерально-биологического комплекса, стимулирует рост микобактерий и позволяет в более ранние сроки устанавливать диагноз на туберкулез.

Использование: изобретение относится к ветеринарной микробиологии, может быть использовано при бактериологической диагностике микобактерий туберкулеза, выделенных из биоматериала животных. Среда содержит яйца куриные, глицерин, вытяжку древесной золы, водный раствор малахитовой зелени и оксидат торфа при следующем соотношении компонентов: яйца куриные 4-5 шт., 2%-ный водный раствор малахитовой зелени 3,33-4 мл, 1,5%-ная вытяжка древесной золы 100 мл, глицерин 1,6-2,5 мл, оксидат торфа 0,1 мл. Среда позволяет ускорить рост микобактерий как в чистой культуре, так и из биоматериала, что сокращает сроки постановки диагноза на туберкулез и повышает точность бактериологической диагностики. 7 табл.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза, включающая яйца куриные, глицерин и малахитовый зеленый, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит вытяжку древесной золы и оксидат торфа при следующем соотношении компонентов:
Яйца куриные, шт. - 4-5
2%-ный водный раствор малахитовой зелени, мл - 3,33-4
1,5%-ная вытяжка древесной золы, мл - 100
Глицерин, мл - 1,6-2,5
Оксидат торфа, мл - 0,1