ПРОЛОНГИРОВАННОЕ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК A61K38/02 

Изобретение относится к области медицины и представляет собой новые ацилированные производные фибринолитических ферментов, предназначенных для терапии тромбоэмболических заболеваний.

Тромбозы и тромбоэмболии, связанные с закупоркой кровеносных сосудов тромбом, являются одним из наиболее распространенных и тяжелых осложнений сердечно-сосудистых заболеваний человека, приводящих к летальному исходу. Терапию тромбоэмболических заболеваний проводят введением тромболитических агентов, которые вызывают растворение внутрисосудистых кровяных сгустков. К тромболитическим агентам относятся: протеолитические ферменты (плазмин, бриназа и др.), которые непосредственно лизируют фибрин тромба, и активаторы плазминогена (урокиназа, стрептокиназа, тканевый активатор плазминогена и проурокиназа), которые превращают эндогенный плазминоген в плазмин, лизирующий тромб.

В последние десятилетия в клиниках в основном использовались активаторы плазминогена старого поколения: урокиназа, выделяемая из мочи человека или из культуральной жидкости клеток почки, и стрептокиназа, являющаяся продуктов секреции гемолитических стрептококков. Однако и урокиназа, и стрептокиназа не имеют специфического сродства к фибрину. Поэтому оба активатора плазминогена в высоких дозах, необходимых для достижения терапевтического эффекта, способны превращать плазминоген в плазмин не только на тромбе, но и в циркуляции. С этим связаны их значительные побочные эффекты на состояние гемостаза, такие как разрушение фибриногена, истощение плазминогена и альфа-2-антиплазмина и др.

В последние годы в терапии тромбозов начато использование тромболитических агентов нового поколения. Одним из них является активатор плазминогена тканевого типа, который получают из культуральной жидкости меланомных клеток человека [1] и методом генной инженерии [2].

Тканевый активатор плазминогена обладает высоким сродством к фибрину. Однако он, равно как стрептокиназа и урокиназа, быстро выводится из циркуляции: время полужизни в плазме человека стрептокиназы - 18 мин, урокиназы - 16 мин и тканевого активатора плазминогена - 9 мин. С высокой скоростью клиренса из кровотока этих трех активаторов связана сложность введения их лечебной дозы путем многочасовой инфузии. Длительная обработка пациента системным введением активаторов стимулирует фибринолитическую систему, результатом чего являются опасные кровотечения из-за разрушения фибриногена и предрасположенность пациента к ретромбозам из-за истощения плазминогена.

Другим представителем тромболитического агента нового поколения является ацилированное по активному центру производное активаторного комплекса плазминоген•стрептокиназа - анизоил-плазминоген•стрептокиназа активаторный комплекс (APSAC, "Eminase", BRL921, Beecham Pharmaceutical, Great Britain) [3] , который находит все более широкое применение в лечебной практике. Обратимо инактивированный по активному центру активаторный комплекс сохраняет сродство к фибрину и остается защищенным от протеолиза и инактивации антиплазмином до реактивации. Как в кровотоке, так и на тромбе APSAC реактивируется с определенной скоростью, что придает ему качества, выгодно отличающие его от других тромболитических агентов: большую длительность действия и простоту введения. Он может быть введен в виде болусной, однократной инъекции без снижения артериального давления. По сравнению со всеми известными активаторами APSAC имеет наибольший период полужизни в плазме человека: 90 мин [4].

Однако терапевтическая доза APSAC (30 мг, которые эквивалентны 1500000 I. U. стрептокиназы) вызывает сопоставимую со стрептокиназой активацию плазминогена в цикруляции с развитием плазминемии [5]. Образование значительных количеств свободного плазмина в циркуляции влечет за собой протеолиз фибриногена, факторов V и VIII, снижение уровня альфа-2-антиплазмина и другие эффекты. Данные эффекты, угрожающие развитием геморрагических осложнений, обусловлены достаточно высокой скоростью реактивации первоначально каталитически инертного ацилактиваторного комплекса в крови. Вследствие этого APSAC используется лишь в неотложной терапии для лечения острого инфаркта миокарда, когда предпочтение отдается ранней перфузии, а другими побочными эффектами препарата приходится пренебречь. Высокая частота геморрагических осложнений, связанная с системным активирующим действием APSAC на фибринолиз, не позволяет использовать его для лечения тромбозов периферических артерий и вен.

Задачей изобретения является создание тромболитического средства, действующего в течение длительного времени, преимущественно в области тромба, и не оказывающего существенного влияния на состояние фибринолиза и содержание фибриногена в системной циркуляции.

Данную задачу решают новые соединения, а именно 4-(N,N,N,-триметиламино)-циннамоильные производные фибринолитических ферментов общей формулы:

где
E - урокиназа, тканевый активатор плазмингена, плазмин, активаторный комплекс плазмин•стрептокиназа, активаторный комплекс плазминоген•стрептокиназа,
где
4-(N,N,N-триметиламино)-циннамоильная группа (4-ТМАЦ-) соединена с серином активного центра фермента.

4-ТМАЦ-Ферменты реактивируются медленнее, чем их 4-анисоильные производные. Например, транс-4-ТМАЦ-плазмин•стрептокиназа активаторный комплекс и 4-анисоил-плазмин•стрептокиназа активаторный комплекс, полученные так, как описано в примере 2, реактивируются в изотонической водной среде (pH 7.4, 37^oC) с полупериодом реактивации 58 мин и 29 мин соответственно, а их времена полужизни в плазме крови человека равны 136 мин и 72 мин соответственно.

Ожидаемый терапевтический эффект от использования предлагаемого ацилактиватора: большая стабильность в кровотоке, большая длительность тромболитического действия и меньшая величина побочных эффектов по сравнению с APSAC. Благодаря малой выраженности системных эффектов предлагаемый ацилактиватор может быть использован для лечения тромбозов периферических сосудов, а также для лечения острого инфаркта миокарда индивидуально или в сочетании со стрептокиназой в зависимости от клинической ситуации.

Способ получения ТМАЦ-производных ферментов заключается в том, что фибринолитический фермент ацилируют по активному центру избытком 4-нитрофенилового эфира цис- или транс-изомеров 4-(N,N,N-триметиламино)-коричной кислоты. Ацилирование проводят при температуре 0-25^oC и pH 7,0-8,5 в течение 10 - 70 мин в отсутствие органического растворителя. Затем полученный ацилфермент отделяют от непрореагировавшего ацилирующего агента и от образовавшегося 4-нитрофенолового эфира гельфильтрацией и белковые фракции лиофилизуют.

Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример N 1.

Получение транс-4-ТМАЦ-плазмина
К 9 мл 15 мкМ раствора плазмина человека (М.В. 85000Д, λ_макс = 280 нм, EI%Iсм

= 17) в 0.1 М трис-HCI буфере pH 8.5, содержащем 0,15 М NaCl, добавляют 1 мл 10 мМ раствора-4-нитрофенилового эфира транс-4-(N,N,N-триметиламино)-коричной кислоты (C₁₈H₁₉JN₂O₄, M. B. 454D, T_пл = 190^oC, λ_макс = 278 НМ, ε_макс = 2,38•10⁴ М^-1 см^-1) в HCl pH 3,0 и инкубируют при 25^oC в течение 10 мин. После дополнительной обработки фермента 0.5 мл ацилирующего агента в течение 5 мин реакционную смесь наносят на колонку с сефадексом G-25. В качестве элюента используют 0,075 М раствор NaCl (4^oC). Белковые фракции лиофилизуют. Выход белого порошка 0.33 г, содержащего 2.8% ацилплазмина. Полученный 4-ТМАЦ-плазмин (М. В. 85 300Д, λ_макс = 272 нм) содержит 1-5% примеси свободного фермента и может быть реактивирован в активный плазмин C τ_I/2 = = 82 мин в изотонической водной среде (pH 7.4; 20%-ный глицерин; 37^oC).

Пример N 2.

Получение транс-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активаторного комплекса.

К 4.5 мл 11,8 мкМ раствора плазминогена человека (М.В. 85000Д, λ_макс = 280 нм, EI%Iсм

= 17) в 0.05 трис-HCl буфере pH 8.0, содержащем 0.15 М NaCl, добавляют навеску (300 000 I.U) стрептокиназы (M.B. 47000Д, λ_макс = 280 нм, EI%Iсм = 10) и смесь инкубируют при 25^oC в течение 15 мин. За ходом образования активаторного комплекса плазмин•стрептокиназа следят по скорости гидролиза 0.6 мМ раствора S-225I на спектрофотометре. Активаторный комплекс обрабатывают раствором 4-нитрофенилового эфира транс-4-(N,N,N-триметиламино)-коричной кислоты (конечная концентрация 0.1 мМ) в течение 40 мин при 25^oC. Затем раствор подвергают гельфильтрации и белковые фракции лиофилизуют так, как описано в примере N 1. Выход твердого порошка 0.25 г, содержащего 2,5% целевого продукта. Полученный транс-4-ТМАЦ-плазмин•стрептокиназа активаторный комплекс (М.В. 132 300Д, λ_макс = 272 нм) реактивируется в изотонической водной среде (pH 7.4; 20%-ный глицерин; 37^oC) c τ_I/2 = = 58 мин.

Пример N 3.

Получение смеси транс-4-ТМАЦ-плазмина и транс-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активаторного комплекса.

К 3 мл 25 мкМ плазминогена в 0.1 М трис-HCl буфере pH 8.0, содержащем 0.15 NaCl, добавляют 3 мл раствора стрептокиназы (71 500 I.U./мл) и инкубируют при 25^oC в течение 10 мин. Полученную смесь фермента и активаторного комплекса обрабатывают с 1.3 мл 10 мМ раствора 4-нитрофенилового эфира транс-4-(N, N,N-триметиламино)-коричной кислоты в HCl pH 3.0 в течение 30-40 мин при 25^oC и далее поступают, как в примере N 1. Выход твердого порошка 0.39 г. Смесь транс-4-ТМАЦ-плазмина и транс-4-ТМАЦ-плазмин•стрептокиназы λ_макс = 272 нм) содержит 2-7% неацилированных ферментов и может быть реактивирован в активный фермент и активаторный комплекс в течение 6 часов в изотонической водной среде (pH 7.4; 20%-ный глицерин; 37^oC).

Пример N 4.

Получение цис-4-ТМАЦ-плазмин•стрептокиназа активаторного комплекса
По способу, описанному в примере N 2, получают цис-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активаторный комплекс. В качестве ацилирующего агента используют 4-нитрофениловый эфир цис-(N,N,N-триметиламино)-коричной кислоты λ_макс = =265 нм, ε_макс = 1,0•10⁴М^-1 см^-1) в конечной концентрации 1 мМ. Реакцию ацилирования проводят в течение 70 мин. Далее поступают так, как описано в примере N 2. Выход твердого порошка 0.27 г., содержащего 1.2% целевого продукта, цис-4-ТМАЦ-плазмин•стрептокиназа активаторный комплекс (М.В. 132300Д, λ_макс = 265 нм) содержит 10-15% неацилированного комплекса и может быть реактивирован в изотонической водной среде (pH 7.4; 20%-ный глицерин; 37^oC) в течение 5 часов.

Пример N 5.

Получение транс-4-ТМАЦ-плазминоген-стрептокиназа активаторного комплекса
К раствору, содержащему стрептокиназу (57200 I.U./мл) и плазминоген (10 мкМ) в 0.05 М трис-HCl буфере pH 7.0, 0.15 М NaCl, добавляют раствор 4-нитрофенилового эфира транс-4-(N,N,N-триметиламино)-коричной кислоты до конечной концентрации 1 мМ и инкубируют 60 мин при 4^oC. Затем раствор подвергают гельфильтрации и белковые фракции лиофилизуют так, как описано в примере N 1. Выход твердого порошка 0.88 г., содержащего 2.1% ацилактиватора, транс-4-ТМАЦ-плазминоген•стрептокиназа активаторный комплекс (М.В. 132 300Д, λ_макс = 272 нм) содержит 5-10% неацилированного комплекса и может быть реактивирован в активный комплекс в изотонической водной среде (pH 7.4; 20%-ный глицерин; 37^oC) c τ_I/2 = 58 мин.

Пример N 6.

Получение транс-4-ТМАЦ-активатора плазминогена тканевого типа
К 1 мл раствора тканевого активатора плазминогена (М.В. 66000Д; λ_макс = 280 нм), содержащего 1 мг/мл фермента, добавляют 0.4 мл 0.1 М трис-HCl буфера pH 7.0, содержащего 0,15 М NaCl, и 0.2 мл запасного раствора 4-нитрофенилового эфира транс-4-(N,N,N-триметиламино)-коричной кислоты (10 мМ) и инкубируют 10 мин при 25^oC. После повторной обработки фермента 0.1 мл ацилирующего агента в течение 3-4 мин, раствор подвергают гельфильтрации на сефадексе G-25 при 4^oC. Белковые фракции замораживают и хранят при -40^oC, транс-4-ТМАЦ-активатор плазминогена тканевого типа (М.В.66 300Д, λ_макс = 272 нм) может быть реактивирован в активный фермент в изотонической водной среде (pH 7.4; 20%-ный глицерин; 37^oC^o).

Пример N 7.

Получение транс-4-ТМАЦ-урокиназы
К 1 мл (25 000 I.U./мл) раствора урокиназы (М.В. 54000Д, λ_макс = 280 нм, EI%Iсм

= 13.6) в 0.05 М трис-HCl буфере pH 8.5 добавляют раствор 4-нитрофенилового эфира транс-4-(N, N,N-триметиламино)-коричной кислоты до конечной концентрации 1 мМ и инкубируют при 25^oC в течение 30-40 мин. За ходом ацилирования следят по падению эстеразной активности фермента во времени, измеряя скорость гидролиза 6 мМ раствора метилового эфира ацетил-глицил-лизина под действием аликвот на pH-стате. Образовавшийся ацилфермент выделяют так, как описано в примере N 6. Полученная транс-4-ТМАЦ-урокиназа (М.В. 54300Д; λ_макс = 272 нм) содержит 1-4% неацилированного фермента и может быть реактивирована в изотонической водной среде (pH 7.4; 20%-ный глицерин; 37^oC) C τ_I/2 = 18 мин.

Пример N 8.

Фибринолитическая активность ацилактиваторов
К 0.9 мл плазмы крови человека добавляют раствор бычьего тромбина до концентрации 4 Ед/мл, выдерживают 1 - 1.5 часа при 25^oC и помещают над сгустком 0.5 мл плазмы человека. В плазму над сгустком добавляют 10 мкл раствора стрептокиназы, активаторного комплекса плазмин•стрептокиназа, 4-транс-ТМАЦ-плазмин•стрептокиназа активаторного комплекса или 4-анисоил-плазмин•стрептокиназа активаторного комплекса, полученных по Примеру N 2, до конечной концентрации 41 мкМ, инкубируют при 37^oC и измеряют уменьшение высоты столба фибринового сгустка (Δl) от времени. Скорость фибринолиза определяют как тангенс угла наклона зависимостей Δl от Δt. Скорость фибринолиза плазменных сгустков, погруженных в плазму, транс-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активаторным комплексом существенно выше, чем стрептокиназой или свободным комплексом плазмин•стрептокиназа, и незначительно ниже, чем 4-анисоил-плазмин•стрептокиназа активаторным комплексом, полученным по примеру N 2 (таблица).

Источники информации
1. Collen D.J., Rijken D., Matsuo O.// Eur.Pat.Appl., 1981, Int.Cl. C 12 N 9/64, A 61 K 37/54.

2. Pennica D., Holmes W.E., Kohr W.J., Harkins R.N., Vehar G.A. et al.// Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E. Coli. Nature, 1983, V.301, P.214-221.

3. Smith R. A. G. // Eur. Pat. Appl., 1980, N 0009879, Int. Cl. A 61 K 37/48, C 12 N 9/68.

4. Ferres H. // Preclinical pharmacological evaluation of anisoylated plasminogen-streptokinase activator complex. Drugs, V.33, (Suppl.3), P.33-50.

5. Collen D.// Coronary thrombolysis: Streptokinase or recombinant tissue-type plasminogen activator? Annals of Internal Medicine, 1990, V.112, P. 529-538.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой новые ацилированные производные фибринолитических ферментов, предназначенных для терапии тромбоэмболических заболеваний. В качестве ацилированных производных ферментов предлагаются 4-(N,N,N-триметиламино)-циннамоильные производные фибринолитических ферментов, таких как урокиназа, тканевый активатор плазминогена, плазмина, активаторных комплексов плазмин стрептокиназа и плазминоген стрептокиназа. Способ получения ацилированных производных ферментов заключается в том, что фибринолитические ферменты ацилируют по серину активного центра избытком 4-нитрофенилового эфира 4-(N, N, N-триметиламино)-коричной кислоты. Ацилирование проводят при температуре 0 - 25^oС и рН 7,0 - 8,5 в течение 10 - 70 мин в отсутствие органического растворителя. Полученные ацилферменты отделяют от непрореагировавшего ацилирующего агента и от образовавшегося 4-нитрофенилового эфира гельфильтрацией или ультрафильтрацией и белковые фракции лиофилизуют. Технический результат изобретения - расширение арсенала тромболитических агентов. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. 4-(N, N,N-триметиламино)-циннамоильное производное фибринолитических ферментов общей формулы

где E - урокиназа, тканевый активатор плазминогена, плазмин, плазмин-стрептокиназа активаторный комплекс, плазминоген-стрептокиназа активаторный комплекс,
в качестве пролонгированного тромболитического агента. 2. Способ получения соединения по п.1, заключающийся в том, что фибринолитический фермент ацилируют по серину активного центра избытком 4-нитрофенилового эфира цис- или транс-изомеров 4-(N,N,N-триметиламино)-коричной кислоты с последующим выделением целевого продукта гельфильтрацией или ультрафильтрацией.