СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИММУНОЗАВИСИМОГО НЕВЫНАШИВАНИЯ АЛЛОГЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ У ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ Российский патент 2014 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к способам моделирования иммунозависимого невынашивания беременности у человека на лабораторных животных. Областью применения изобретения являются фундаментальные исследования в области иммунологии беременности и доклиническая оценка средств и методов профилактики и терапии невынашивания беременности иммунной этиологии.

Для изучения патогенеза репродуктивных потерь, разработки новых эффективных диагностических, профилактических и терапевтических мер, направленных на сохранение беременности, широко используют экспериментальные модели невынашивания беременности in vivo. При этом исследования часто выполняются на мышах, которые обладают типом строения плаценты и маточно-плацентарной области, характером материнского и плодного кровообращения, близкими к таковым у человека. Существуют сингенные и аллогенные модели индуцированных абортов у мышей [17]. Наиболее адекватно привычное невынашивание беременности неустановленной этиологии воспроизводит мышиная модель, в условиях которой при скрещивании различающихся по антигенам главного комплекса гистосовместимости самок линии CBA/J (Н-2k) с самцами линии DBA/2 (Н-2d) наблюдается частота эмбриональных потерь от 10 до 30% в отсутствие экзогенных абортогенных факторов [11, 13]. Недостатком модели является невысокий уровень резорбции эмбрионов, а также связь невынашивания беременности с биологическими особенностями данных линий мышей, затрудняющих экстраполяцию данных на патологию человека.

Наиболее близким к заявленному является способ моделирования абортов при аллогенной беременности у лабораторных животных, вызванных введением самкам липополисахарида (ЛПС) - компонента стенки грамотрицательных бактерий [10, 12]. Недостатком модели является то, что ЛПС вызывает активацию иммунной системы, приводящую к развитию системного воспалительного ответа с вовлечением множественных патогенетических механизмов, приводящих к нарушению функций ряда систем организма - эндокринной, сердечно-сосудистой, дыхательной, выделительной, пищеварительной. Поэтому ЛПС-индуцированные аборты у мышей не являются вполне адекватной моделью для исследования иммунологических механизмов невынашивания.

Задача изобретения - получение воспроизводимого иммуноопосредованного невынашивания аллогенной беременности с высокой частотой резорбции эмбрионов у линейных и нелинейных лабораторных мышей.

Заявленный способ моделирования иммунозависимого невынашивания аллогенной беременности заключается во введении самкам мышей гликозида мурамилдипептида - N-ацетил-β-1-О-гептилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина (С7МДП), внутрибрюшинно в дозе 20 мкг в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное (1 мг/кг) в период завершения имплантации бластоцисты (5-е сутки беременности) и в начале периода плацентации (7-е сутки беременности). Выбранная доза С7МДП соответствует ED₅₀, определенной в предварительной серии экспериментов на септических моделях in vivo [4, 5]. Выбор вводимого вещества обусловлен тем, что мурамилдипептид является компонентом пептидогликана клеточной стенки бактерий и известен как эффективный модификатор биологических реакций [3], а β-гликозилирование - как один из доказанных вариантов увеличения иммуномодулирующей активности молекулы МДП [1, 2, 8]. Гликозиды МДП, в частности С7МДП, обладают способностью направлять дифференцировку Т-хелперов в сторону Th1-клеток и тем самым стимулировать клеточные иммунные реакции [7, 15] и продукцию провоспалительных цитокинов: интерферона-γ (ИФН-γ), фактора некроза опухоли (ФНО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1) [6, 9]. С другой стороны С7МДП усиливает продукцию цитокинов ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, связанных с гуморальным (Th2) типом иммунного ответа [9], характерным для нормально протекающей беременности [17]. Абортогенный эффект Th1 цитокинов при аллогенной беременности доказан введением самкам СВА×DBA/2 высоких доз ИФН-γ и/или ФНО-α [11], ИЛ-12 [16]. Однако концентрация Тh1 цитокинов, достаточная для реализации противоопухолевого и противоинфекционного эффектов С7МДП на моделях опухолевого роста и сепсиса у мышей-самцов C57BL/6 [3, 4, 5, 8], может не достигать уровней, вызывающих аборты (резорбцию эмбрионов) у беременных самок. Таким образом, плейотропные эффекты С7МДП в отношении продукции Th1 и Th2 позволяют предположить как толерогенное, так и абортогенное действие при аллогенной беременности у нелинейных самок и самок СВА. Кратность и сроки введения препарата были выбраны для обеспечения длительного повышения уровня цитокинов, являющихся короткоживущими молекулами из-за непродолжительности времени синтеза и высокой скорости выведения, в период от завершения имплантации бластоцисты до начала формирования плаценты, чтобы исключить возможность негативного влияния С7МДП на процесс имплантации и/или плацентации.

Для оценки эффективности заявленного способа провели исследование уровня эмбриональных потерь у линейных мышей с высоким уровнем спонтанных абортов.

Пример 1. Влияние С7МДП на уровень эмбриональных потерь при аллогенной беременности у линейных мышей с высоким уровнем спонтанных абортов (♀CBA/J×♂DBA/2).

Для исследования влияния С7МДП на частоту резорбции использовали 8-10-недельных мышей инбредных линий CBA/J (самки) и DBA/2 (самцы), с массой тела 23-25 г, полученных из филиала «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария НИИ морфологии человека РАМН. Эксперименты начинали после 2-недельной адаптации мышей к условиям вивария и осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР №577 от 12 августа 1977 г. Самок и самцов ссаживали в соотношении 3:1, день появления копулятивной пробки обозначали как 1-й день беременности. Наступление беременности верифицировали по нарастанию уровня прогестерона в сыворотке крови, полученной из хвостовой вены на 5-й день предполагаемой беременности, методом иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов для иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови «Прогестерон-ИФА» (фирма Хема-Медика, Россия). С7МДП вводили внутрибрюшинно на 5-е и 7-е сутки беременности в дозе 20 мкг в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное (≈1 мг/кг). Беременным самкам контрольных групп внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл 0,9% раствора NaCl в том же режиме. Животных выводили из эксперимента на 14-е сутки беременности и определяли частоту резорбции эмбрионов по формуле: число резорбированных эмбрионов/(число резорбированных+число живых эмбрионов)×100% [13]. Результаты представляли в виде среднего±стандартное отклонение. Межгрупповые сравнения проводили с использованием z-критерия с коррекцией Йейтса, различия считали значимыми при p<0,05. Данные проанализированы с помощью программы «Sigma Stat 3.5» (Systat Software, Inc.).

Использование заявленного способа позволило увеличить частоту резорбции эмбрионов с 31,7±5,32% до 50,0±6,54% и продемонстрировало высокую воспроизводимость (табл.1).

Таблица 1 Экспериментальные группы Число резорбированных эмбрионов/общее число эмбрионов Частота резорбции, % М±m 1. Контрольная ♀CBA/J×♂DBA/2 (n=6) 13/41 31,7±5,32 2. Опытная ♀CBA/J×♂DBA/2+С7МДП (n=6) 17/34 50,0±6,54

Повышение частоты резорбции данным способом придает известной модели спонтанного аборта у мышей CBA/J×DBA/2 максимальную чувствительность для оценки разнонаправленных воздействий на иммунозависимое невынашивание беременности. Это очень важно с позиции сокращения времени исследования и числа экспериментальных животных, используемых для решения практических задач и проверки научных гипотез, связанных с разработкой подходов к предотвращению/лечению спонтанных абортов и с изучением безопасности средств и методов, которые предполагается использовать во время беременности.

Для оценки эффективности заявленного способа моделирования иммунологического невынашивания аллогенной беременности у линейных животных с нормальной фертильностью было проведено исследование на мышах линий СВА и Balb/c.

Пример 2. Влияние С7МДП на уровень эмбриональных потерь при аллогенной беременности у линейных мышей с нормальной фертильностью (♀CBA/J×♂BALB/c).

Для исследования влияния С7МДП на частоту резорбции использовали 8-10-недельных мышей инбредных линий CBA/J (самки) и BALB/c (самцы), с массой тела 23-25 г, полученных из филиала «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария НИИ морфологии человека РАМН. При внутрибрюшинном введении на 5-е и 7-е сутки беременности 0,9% раствора NaCl показатели резорбции эмбрионов на 14-й день гестации у самок CBA/J, оплодотворенных самцами BALB/c, составил 16,2±3,96% (табл.2). Двукратное внутрибрюшинное введение С7МДП приводило к резорбции эмбрионов у всех животных опытной группы и статистически значимо увеличивало частоту резорбции эмбрионов в условиях фертильного контроля CBA/J×BALB/c до 45,4±6,31%.

Таблица 2 Экспериментальные группы Число резорбированных эмбрионов / общее число эмбрионов Частота резорбции, % М±m Достоверность различий 1. ♀CBA/J×♂BALB/c (n=7) 6/37 16,2±3,96   P_1-2=0,017 2. ♀CBA/J×♂BALB/с +С7МДП (n=5) 15/33 45,4±6,31

Достигнутый благодаря применению С7МДП высокий уровень резорбции эмбрионов при фертильном сочетании у мышей CBA/J×BALB/c указывает на высокую эффективность данной модели.

Одной из трудностей использования моделей различных патологических процессов на линейных животных является сложность экстраполяции полученных результатов на человека, обусловленная физиологическими особенностями линий животных, в первую очередь особенностями функционирования иммунной системы. В связи с этим для расширения применимости модели и приближения ее к патологии беременности у человека было проведено моделирование невынашивания беременности у нелинейных лабораторных мышей.

Пример 3. Влияние С7МДП на уровень эмбриональных потерь при аллогенной беременности у нелинейных мышей.

В работе использовали 8-10-недельных самок F1, полученных от скрещивания ♀CBA/J×♂DBA/2, оплодотворенных самцами F1, полученных от скрещивания ♀CBA/J×♂BALB/c. Потомство F1 было получено в виварии ФГБУ «НИИ морфологи человека» РАМН. Количество животных в контрольной и экспериментальной группах - 5.

У животных контрольной группы резорбции эмбрионов на 14-й день беременности не наблюдали (табл.3). Двукратное введение С7МДП на 5-е и 7-е сутки беременности вызывало резорбцию эмбрионов у 100% животных, уровень которой варьировал от 12,5% до 37,5%, составляя в среднем 27,78±10,94%, что статистически значимо превышало показатель контрольной группы.

Таблица 3 Экспериментальные группы Число резорбированных эмбрионов/ общее число эмбрионов Частота резорбции, % M±m Достоверность различий 1. ♀F1CBA×DBA×♂F1 CBA×BALB/c (n=5) 0/42 0% Р_1-2=0,036 2. ♀F1CBA×DBA×♂F1 CBA×BALB/c+С7МДП (n=5) 6/22 27,78±10,94%

Известно, что частота репродуктивных потерь при нормальной беременности у мышей составляет менее 10% и обусловлена элиминацией эмбрионов с хромосомными аномалиями [10, 14]. Следовательно, увеличение частоты резорбции после введения иммуномодулятора С7МДП нелинейным беременным самкам обусловлено иммунологическими причинами.

Техническим результатом заявленного решения является достижение высокого уровня резорбции эмбрионов у линейных и нелинейных мышей с нормальной фертильностью, а также повышение частоты резорбции эмбрионов у мышей со спонтанными абортами при 100%-ной воспроизводимости модели.

Литература

1. Земляков А.Е., Цикалов В.В., Калюжин О.В., Курьянов В.О., Чирва В.Я. Гликозиды N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина. Влияние конфигурации гликозидного центра и природы агликона на биологическую активность // Биоорганическая химия. - 2003. - Т.29. - №3. - С.316-322.

2. Калюжин О.В. Иммуномодулирующая активность гликозидных производных N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина // Вестник новых медицинских технологий. - 2003. - Т.10. - №1-2. - С.28-32.

3. Калюжин О.В. Производные мурамилдипептида в эксперименте и клинике // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - №1. - С.104-108.

4. Калюжин О.В., Калина Н.Г., Баштаненко А.Ф., Шкалев М.В., Кузовлев Ф.Н., Калюжин В.В. Стимуляция резистентности мышей к бактериальной инфекции гликозидами мурамилдипептида // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т.135. - №5. - С.531-535.

5. Калюжин О.В., Калюжин В.В., Земляков А.Е., Елкина С.И., Шкалев М.В., Сергеев В.В. Стимуляция неспецифической резистентности мышей β-гептилгликозид-мурамилдипептидом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т.127. - №5. - С.543-545.

6. Калюжин О.В., Нелюбов М.В., Калюжина Е.В., Кузовлев Ф.Н., Шкалев М.В. Влияние конфигурации гликозидной связи и структуры агликона гликозидов мурамилдипептида на их способность стимулировать продукцию интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли макрофагами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т.134. - №9. - С.326-328.

7. Калюжин О.В., Фукс Б.Б., Бовин Н.В., Земляков А.Е., Чирва В.Я. Иммуномодулирующая активность новых производных мурамилдипептида in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - Т.117. - №5. - С.510-513.

8. Караулов А.В. Калюжин О.В., Земляков А.Е. Биологическая активность гликозидных производных N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - Т.1. - №1. - С.14-24.

9. Михайлова Л.П., Макарова О.В., Калюжин О.В., Трунова Г.В., Диатроптов М.Е., Серебряков С.Н. Влияние глимурида на продукцию цитокинов спленоцитами мышей C57BL/6 и BALB/c // Иммунология. - 2004. - Т.25. - №3. - С.152-154.

10. Chaouat G., Menu Е., Clark D.A. et al. Control of fetal survival in CBA x DBA/2 mice by lymphokine therapy // J. Reprod. Fertil. - 1990. - Vol.89 (2). - P.447-458.

11. Clark D.A., Chaouat G., Arck P.C. et al. Cutting Edge: Cytokine-dependent abortion in CBA x DBA/2 mice is mediated by the procoagulant fgl2 prothrombinase // J. Immunology. - 1998. - Vol.160. - P.545-549.

12. Clark D.A. Manuel J. Lee L. et al. Ecology of danger-dependent cytokine-boosted spontaneous abortion in the СВА x DBA/2 mouse model. I. Synergistic effect of LPS and (TNF-alpha+IFN-gamma) on pregnancy loss // Am. J. Reprod. Immunol. - 2004. - Vol.52 (6). - P.370-378).

13. Du M.-R., Dong L., Zhou W.-H. et al. Cyclosporin A improves pregnancy outcome by promoting functions of trophoblasts and inducing maternal tolerance to the allogeneic fetus in abortion-prone matings in the mouse // Biol. Reproduction. - 2007. - Vol.76. - P.906-914.

14. Girardi G. Yarilin D., Thurman J. M. et al. Complement activation induces dysregulation of angiogenic factors and causes fetal rejection and growth restriction // JEM. - 2006. - Vol.203 (9). - P.2165-2175.

15. Kalyuzhin O.V., Zemlyakov A.E. & Fucks B.B. Distinctive immunomodulating properties and interactivity with model membranes and cells of two homologous muramyl dipeptide derivatives // Int. J. Immunopharmacol. - 1996. - Vol.18 (11). - P.651-659.

16. Knackstedt M.K., Zenclussen A.C., Hertwig K. et al. Th1 cytokines and the prothrombinase fgl2 in stress-triggered and inflammatory abortion // Am. J. Reprod. Immunol. - 2003. - Vol.49 (4). - P.210-220.

17. Kwak-Kim J., Park J. Ch., Kyong H. et al. Immunological modes of pregnancy loss // Am. J. Reprod. Immunol. - 2010. - Vol.63 (6). - P.611 - 623.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования иммунозависимого невынашивания беременности для изучения иммунологии и иммунопатологии беременности, оценки эффективности доклинических испытаний способов лечения и профилактики невынашивания беременности иммунной этиологии. Способ включает введение самкам лабораторных мышей N-ацетил-β-1-О-гептилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина внутрибрюшинно в дозе 20 мкг в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное. Введение осуществляют на 5-е сутки беременности в период имплантации бластоцисты и на 7-е сутки в начале периода плацентации. Способ обеспечивает высокий уровень резорбции эмбрионов, высокую воспроизводимость модели и возможность использования как линейных, так и нелинейных животных. 3 пр., 3 табл.

Способ моделирования иммунозависимого невынашивания аллогенной беременности у лабораторных мышей, заключающийся введением самкам мышей N-ацетил-β-1-О-гептилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина внутрибрюшинно в дозе 20 мкг в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное (≈1 мг/кг) внутрибрюшинно на 5-е сутки беременности в период имплантации бластоцисты и на 7-е сутки беременности в начале периода плацентации.