Способ получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса Российский патент 2024 года по МПК C08B37/08 A61K31/722 

Изобретение относится к области пищевой, фармацевтической, химической промышленности и биотехнологии, в частности к химической модификации хитин-глюкановых комплексов из биомассы высших грибов и предназначено для получения карбоксиметиловых эфиров хитин-глюкановых комплексов.

Хитин является основой экзоскелета панцирей ракообразных, а также входит в состав клеточной стенки грибов, водорослей, дрожжей и некоторых бактерий. Основные объемы коммерческого хитина производятся как побочный продукт из панцирей ракообразных, однако, исследования по выделению хитина из биомассы грибов в настоящее время вызывают огромный интерес за счет биотехнологического способа их получения. Также это связано с тем, что для полного удаления минеральных и белковых веществ из панцирей ракообразных необходима их обработка в жестких условиях, в то время, как выделение хитина из биомассы грибов проводится в мягких условиях и является простым, экономически эффективным и более экологичным способом. Кроме того, традиционное производство хитина из панцирей ракообразных подвержено сезонным поставкам и географическим ограничениям, что делает его дорогостоящим, ограниченно доступным и трудоемким. Учитывая преимущества, биомасса грибов может быть позиционирована в качестве альтернативного и перспективного источника хитина.

Хитин в клеточной стенке грибов представлен хитин-глюкановым комплексом (ХГК) - связь хитина с β-1,3-глюканами с помощью ковалентных связей. Глюканы, связанные с хитином, придают комплексу дополнительную прочность и эластичность, а также обладают высокой биологической активностью.

Ограниченная растворимость хитин-глюкановых комплексов в водной среде при физиологическом значении рН (7,0-7,4) является существенной преградой для исследований in vivo. Получение водорастворимых производных ХГК способствует решению этой проблемы.

Одним из перспективных направлений модифицирования ХГК, позволяющее получать растворимые формы в широком интервале рН является карбоксиметилирование (алкилирование). Образующиеся в результате такой модификации производные являются более сильными комплексовбразователями, чем исходный ХГК. Ковалентное модифицирование остатками карбоновых кислот придает молекулам ХГК амфолитный характер, повышает адгезионные свойства полимера к различным подложкам, в особенности, к поверхностям биологического происхождения, что позволяет использовать карбоксиметилхитин-глюкановые комплексы (КМХГК) в качестве компонентов медицинских изделий.

В настоящее время, в основном, широко известны карбоксиметильные производные хитозана, которые обладают антибактериальной, антигрибковой активностью, используются для ускорения восстановления живых тканей, в системах доставки лекарств. Карбоксиметильные производные ХГК описаны скудно. Поэтому, задача разработки способов синтеза и исследования свойств карбоксиметилхитин-глюкановых комплексов является актуальной, поскольку их применение потенциально шире и перспективнее по сравнению с исходным ХГК.

В связи с этим проводят обработку хитинового или хитозанового сырья алкилирующими агентами. Этой обработке обычно предшествует обработка гидроксидом натрия, для активации сырья и обеспечения требуемой степени деацетилирования. Из уровня техники известно несколько аналогов предлагаемого способа.

Известен, например, способ получения карбоксиметилового эфира хитозана (Пат. 2044741 Российская Федерация, МПК С08В 37/08. Способ получения карбоксиметилового эфира хитозана / Н.С. Ениколопов, С.З. Роговина, Т.А. Акопова, С.Н. Зеленецкий, Г.А. Вихорева; заявитель и патентообладатель Институт синтетических полимерных материалов РАН. - №5066841/05; заявл. 20.07.1992; опубл. 27.09.1995.), включающий обработку хитина едким натром и монохлоруксусной кислотой (ее солью), при этом обработку осуществляют при воздействии сдвиговых напряжений 0,3-3,0 Н/мм², давлении 0,2-50 МПа и молярном соотношении хитин : едкий натр : монохлоруксусная кислота (ее соль) 1:2,6-8,4:2,3-4 соответственно при 60-200°С, причем монохлоруксусную кислоту (ее соль) вводят в твердом виде или в виде раствора в изопропиловом спирте при модуле не более 1.

Недостатком данного способа является использование высокой температуры (200°С) при проведении реакции за счет чего может происходить частичное разложение хитина, а также большой расход реагентов. Обработка при высоком давлении усложняет и удорожает оборудование для проведения процесса.

Известен способ получения карбоксиметилхитозана (Пат. 2185387 Российская Федерация, МПК С08В 37/08, A61K 31/722. Способ получения карбоксиметилхитозана / А.В. Иванов, О.Р. Гартман, Н.Г. Базарнова, В.М. Раевских; заявитель и патентообладатель Алтайский государственный медицинский университет. - №2000116314/04; заявл. 20.06.2000; опубл. 20.07.2002.), включающий диспергирование хитозана в среде органического растворителя, мерсеризацию в щелочной среде, карбоксиметилирование хитозана монохлоруксусной кислотой, согласно которому карбоксиметилирование хитозана проводят при нагревании при температуре 60°С в течение 3-4 ч, затем оставляют реакционную смесь при температуре 25°С в течение 12-20 ч, с последующим добавлением раствора ледяной уксусной кислоты в безводном этаноле до нейтрализации (рН 7).

Основным недостатком способа является большая длительность процесса получения карбоксиметилхитозана до 24 часов.

Известен способ получения карбоксиметилхитина (Пат.CN103288980A Китайская народная республика, МПК С08В 37/08 Preparation method of carboxymethyl chitin / S. Xiaowen, D. Fuyuan, D. Hongbing, Y. Hua, D. Yumin; заявитель и патентообладатель Hubei provence qianjiang city huashan aquatic food Co Ltd. - №201310237735.1; заявл. 14.06.2013; опубл. 11.09.2013.), который включает следующие стадии: (1) растворение хитина в смешанном растворе NaOH и CO(NH₂)₂; (2) добавление в раствор монохлорацетата натрия в соотношении 1:(4-20) при перемешивании, температуре 0-20°С в течение 72-120 ч и нейтрализация раствора до значения рН 7,0 разбавленной соляной кислотой; (3) диализ раствора, содержащего хитин и сушка.

Недостатками известного способа являются большая длительность процесса получения карбоксиметилхитина от 72 до 120 ч, а также длительный процесс диализа (7 дней), в совокупности длительность процесса превышает 11 дней, использование смешанного растворителя, что делает процесс дополнительно гетерогенным и трудно управляемым, большой расход реагентов.

Известен способ получения карбоксилсодержащих производных хитозана (Пат. 2100373С1 Российская Федерация, МПК С08В 37/08. Способ получения карбоксилсодержащих производных хитозана / С.З. Роговина, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева, С.Н. Зеленецкий, Т.А. Акопова; заявитель и патентообладатель Институт синтетических полимерных материалов РАН. - №96114829/04; заявл. 23.07.1996; опубл. 27.12.1996.), проводимый взаимодействием хитозана с карбоксилсодержащим реагентом. Взаимодействие исходных веществ осуществляют в твердом виде в условиях воздействия сдвиговых напряжений и давления до 50 МПа при 25-100°С. В качестве карбоксилсодержащего реагента используют дикарбоновую кислоту из ряда: янтарная, малоновая, либо ангидрид дикарбоновой кислоты из ряда: янтарный, малеиновый, фталевый, в количестве 0,25-1,5 моль на 1 моль аминогрупп хитозана.

Недостатком способа является использование высокого давления до 50 МПа, дорогостоящего оборудования и реактивов при карбоксиметили-ровании хитозана.

Наиболее близким техническим решением является способ получения карбоксиметилового эфира хитина (А.с. 1666459 СССР, МПК С08В 37/08. Способ получения карбоксиметилового эфира хитина / Д.Ю. Гладышев, Г.А. Вихорева, Л.С. Гальбрайх; заявитель и патентообладатель Московский текстильный институт им. А.Н. Косыгина. - №4717385; заявл. 10.07.1989; опубл. 30.07.1991.), согласно которому хитин активируют водным раствором гидроокиси натрия в присутствии изопропанола при массовом соотношении хитина, гидроокиси натрия, изопропанола и воды 1:(1,04-1,1):(9,4-10,6):(1,1-1,3) соответственно 2,5-3,0 ч при 23-30°С с последующим алкилированием монохлоруксусной кислотой в присутствии изопропанола при массовом соотношении хитина, монохлоруксусной кислоты и изопропилового спирта 1:(1,12-1,20):(0,81-2,40) соответственно 1,5-2,0 ч при 70-80°С.

Недостатки - большая длительность процесса (от 3,5 до 5,5 ч); использование повышенных температур (70-80°С), которое может привести к частичному разложению продукта и снижению выхода продукта. Данный способ принят за прототип.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса, сокращение продолжительности процесса, повышение технологичности процесса, уменьшение расхода реагентов. Из уровня техники способов, с помощью которых можно было бы реализовать техническую задачу в заявленном сочетании признаков, не выявлено.

Поставленная техническая задача решается тем, в способе получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса под воздействием ультразвукового излучения, включающем обработку хитин-глюканового комплекса в среде изопропилового спирта с гидроксидом натрия и последующим алкилированием монохлорацетатом натрия, в качестве продуцента хитин-глюканового комплекса используют биомассу мицелия высших грибов Armillaria mellea, при взаимодействии хитин-глюканового комплекса с гидроксидом натрия, а затем с монохлоруксусной кислотой, проводят обработку ультразвуковым излучением мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 10-30 мин, затем продукт отмывают подкисленным минеральной кислотой этанолом и высушивают на воздухе. В вариантах способа, в качестве алкилирующего агента используют натриевую соль монохлоруксусной кислоты, соотношение хитиновое сырье : алкилирующий агент составляет 1,0:1,7 (масс). Предлагаемый способ позволит обеспечить сокращение продолжительности процесса, повышение технологичности процесса, уменьшение расхода реагентов. Достигнутые показатели продукта позволяют использовать его в качестве эффективного компонента в составе ранозаживляющих гелевых и пленочных материалов.

Для достижения заявленного технического результата применяют ультразвуковое воздействие на хитин-глюкановый комплекс из биомассы мицелия грибов, что приводит к нарушению диффузионного слоя хитина и, как следствие, быстрому проведению реакций деацетилирования и карбоксиметилирования. В результате сокращается продолжительность процесса. Эффективное воздействие ультразвука позволяет также уменьшить расход реагентов.

Предлагаемая ультразвуковая обработка является двухстадийной, на первой стадии происходит деацетилирование хитин-глюканового комплекса гидроксидом натрия в среде изопропилового спирта, на второй стадии происходит карбоксиметилирование монохлорацетатом натрия также в среде изопропилового спирта. При этом модуль обработки (соотношение сырья и жидкости) в заявляемом способе не меняется, в отличие от прототипа, что повышает технологичность процесса, снижает расход реагентов, сокращает продолжительность процесса.

Длительность ультразвуковой обработки 10-30 минут позволяет обеспечить полное проведение реакций активации, достижения необходимой степени деацетилирования хитинового сырья и алкилирования хитинового сырья в заявленных соотношениях реагентов. При длительности менее 10 минут, процесс не завершается полностью, что снижает выход продукта. При длительности свыше 30 минут возрастает расход энергии на обработку, повышается температура реакционной смеси, усиливается гидролиз продукта, происходит побочная реакция деацетилирования продукта, снижается выход продукта.

Соотношение хитиновое сырье тидроксид натрия составляет не больше, чем 1,0:1,0 (масс.), что меньше, чем по прототипу. В условиях ультразвуковой обработки такое соотношение обеспечивает проведение полной активации хитинового сырья, достижения необходимой степени деацетилирования, при этом снижается расход реагентов.

Соотношение хитиновое сырье : изопропиловый спирт составляет 1,0:4,0-9,0 (масс.), что меньше, чем по прототипу. В условиях ультразвуковой обработки такое соотношение обеспечивает проведение полноценной активации и алкилирования хитинового сырья, при этом снижается расход реагентов. Использование соотношение хитиновое сырье : изопропиловый спирт ниже, чем 1,0:4,0, известное из уровня техники, создает более вязкую реакционную смесь, что затрудняет обработку ультразвуком и не позволяет сократить продолжительность процесса.

Нейтрализацию и промывку по заявляемому способу проводят смесью этилового спирта и минеральной кислоты. Из уровня техники известно использование для промывки продуктов реакции получения кармоксиметилхитина или карбоксиметилхитозана этилового спирта, но только в сочетании с ледяной уксусной кислотой. Также известно для нейтрализации продуктов реакции использование минеральной кислоты, в частности, соляной кислоты, но без органического растворителя. Использование заявляемых признаков в совокупности, смеси этилового спирта и минеральной кислоты, для промывки твердой фазы продуктов реакции алкилирования активированного хитинового сырья, не известно. Применение смеси этилового спирта и минеральной кислоты, после обработки ультразвуком позволяет повысит технологичность процесса.

Также в качестве источника хитин-глюканового комплекса используют биомассу мицелия опенка осеннего (Armillaria mellea), полученную биотехнологическим способом. Такой вид хитинового сырья обладает большей доступностью. Внутренняя структура такого хитинового сырья более податлива при обработки гидроксидом натрия, натриевой солью монохлоруксусной кислоты, в среде изопропилового спирта, при ультразвуковой обработке, что повышает технологичность процесса и позволяет сократит продолжительность процесса.

В одном из вариантов способа в качестве алкилирующего агента используют натриевую соль монохлоруксусной кислоты, вместо монохлоруксусной кислоты. Этот компонент менее гигроскопичен, а также при обработке смеси хитин-глюканового комплекса и гидроксида натрия выделяет меньшее количество тепловой энергии, минимально повышая температуру реакционной смеси, что положительно сказывается на технологичности процесса.

В другом варианте способа соотношение хитиновое сырье : алкилирующий агент составляет 1,0:1,7 (масс). При использовании ультразвуковой обработки этого соотношения достаточно для проведения реакции алкилирования. Такое соотношение это позволяет уменьшить расход реагентов.

Предлагаемый способ получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса может быть осуществлен следующим образом. Реакции активации (деацетилирования) хитинового сырья гидроксидом натрия и алкилирования (карбоксиметилирования) монохлорацетатом натрия в среде изопропилового спирта могут быть проведены в ультразвуковой ванне или в ультразвуковом проточном аппарате. Разделение продуктов реакции может быть выполнено путем фильтрования на вакуум-фильтре или путем декантации. Промывка и нейтрализация твердой фазы продуктов реакции может проводиться до отрицательной реакции на щелочь по фенолфталеину и на хлорид ионы с раствором нитрата серебра. Сушка может осуществляться на воздухе или сушильном шкафу. Проведение процесса по предлагаемому способу позволяет существенно сократить продолжительность взаимодействия реагентов.

Предлагаемое изобретение позволяет сократить продолжительность получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса по сравнению с прототипом (с 3,5-5,5 ч до 40 мин). Достигнутые показатели продукта позволяют использовать его в качестве эффективного компонента в составе ранозаживляющих гелевых и пленочных материалов.

Предлагаемый способ получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса, в совокупности заявленных признаков, обеспечивает сокращение продолжительности процесса, повышение технологичности процесса, уменьшение расхода реагентов.

Возможность получения заявленного технического результата подтверждаются следующими примерами.

Пример 1

К навеске хитин-глюканового комплекса (5 г) добавляют гидроксид натрия (2,91 г) и энергично перемешивают. В полученную массу вносят изопропиловый спирт (50 мл) и проводят обработку в ультразвуковой ванне мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 10 мин. После этого в смесь добавляют Na-МХУК (8,5 г), тщательно перемешивают и снова подвергают ультразвуковому воздействию при частоте 28 кГц в течение 10 мин. Полученный продукт отделяют декантацией, промывают 70%-ным этиловым спиртом, содержащим для нейтрализации 90%-ную уксусную кислоту, до отрицательной реакции на щелочь по фенолфталеину и на хлорид ионы с раствором нитрата серебра. После нейтрализации продукт сушат на воздухе.

Выход КМХГ составляет 0,90 г.

Пример 2

К навеске хитин-глюканового комплекса (5 г) добавляют гидроксид натрия (2,91 г) и энергично перемешивают. В полученную массу вносят изопропиловый спирт (50 мл) и проводят обработку в ультразвуковой ванне мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 20 мин. После этого в смесь добавляют Na-МХУК (8,5 г), тщательно перемешивают и снова подвергают ультразвуковому воздействию при частоте 28 кГц в течение 20 мин. Полученный продукт отделяют декантацией, промывают подкисленным минеральной кислотой этанолом и высушивают на воздухе как в примере 1.

Выход КМХГК составляет 5,75 г (1,15 г/г сырья).

Пример 3

К навеске хитин-глюканового комплекса (5 г) добавляют гидроксид натрия (2,91 г) и энергично перемешивают. В полученную массу вносят изопропиловый спирт (50 мл) и проводят обработку в ультразвуковой ванне мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 30 мин. После этого в смесь добавляют Na-МХУК (8,5 г), тщательно перемешивают и снова подвергают ультразвуковому воздействию при частоте 28 кГц в течение 30 мин. Полученный продукт отделяют декантацией, промывают подкисленным минеральной кислотой этанолом и высушивают на воздухе как в примере 1.

Выход КМХГ составляет 3,75 г (0,75 г/г сырья).

Пример 4

К навеске хитин-глюканового комплекса (5 г) добавляют гидроксид натрия (2,91 г) и энергично перемешивают. В полученную массу вносят изопропиловый спирт (50 мл) и проводят обработку в ультразвуковой ванне мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 10 мин. После этого в смесь добавляют Na-МХУК (8,5 г), тщательно перемешивают и снова подвергают ультразвуковому воздействию при частоте 28 кГц в течение 20 мин. Полученный продукт отделяют декантацией, промывают подкисленным минеральной кислотой этанолом и высушивают на воздухе как в примере 1.

Выход КМХГ составляет 5,25 г (1,05 г/г сырья).

Пример 5

К навеске хитин-глюканового комплекса (5 г) добавляют гидроксид натрия (2,91 г) и энергично перемешивают. В полученную массу вносят изопропиловый спирт (50 мл) и проводят обработку в ультразвуковой ванне мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 20 мин. После этого в смесь добавляют Na-МХУК (8,5 г), тщательно перемешивают и снова подвергают ультразвуковому воздействию при частоте 28 кГц в течение 30 мин. Полученный продукт отделяют декантацией, промывают подкисленным минеральной кислотой этанолом и высушивают на воздухе как в примере 1.

Выход КМХГ составляет 4,25 г (0,85 г/г сырья).

Из представленных примеров следует, что предлагаемый способ карбоксиметилирования хитин-глюканового комплекса позволяет значительно снизить общую продолжительность процесса (с 3,5-5,5 ч до 60 мин), при этом получая продукты со сравнимым выходом (выход карбоксиметилхитина по прототипу составляет от 0,30 до 1,43 г/г сырья).

Использование предлагаемого способа получения КМХГК в сравнении с существующим способом согласно прототипу, имеет следующие преимущества:

- сокращение продолжительности получения карбоксиметилированных производных ХГК за счет ультразвукового воздействия и использования более податливого вида хитинового сырья (с 3,5-5,5 ч до 40 мин), неизменности модуля (жидкость : твердое) на стадии активации и алкилирования, интенсивности ультразвуковой обработки;

- улучшение технологичности процесса за счет использования в качестве алкилирующего агента менее гигроскопичного монохлорацетата натрия, в отличие от монохлоруксусной кислоты, использования для нейтрализации и промывки твердой фазы продуктов реакции смеси этилового спирта и минеральной кислоты, использования податливого вида хитинового сырья;

- сокращение расхода реагентов за счет меньших соотношений хитинового сырья, гидроксида натрия, изопропилового спирта, неизменности модуля (жидкость : твердое) на стадии активации и алкилирования, интенсивности ультразвуковой обработки.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса, включающий обработку хитин-глюканового комплекса из биомассы мицелия высших грибов Armillaria mellea гидроксидом натрия в среде изопропилового спирта при соотношении хитинового сырья : гидроксида натрия, как 1,0:0,58 (масс.) и при соотношении хитинового сырья : изопропилового спирта, как 1,0:7,86 (масс.), затем проводят обработку ультразвуком мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 10-30 мин, добавляют алкилирующий агент монохлорацетат натрия при соотношении хитиновое сырье:алкилирующий агент 1,0:1,7 (масс.), проводят обработку ультразвуком мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 10-30 мин, нейтрализуют, промывают смесью этилового спирта и уксусной кислоты и высушивают. Изобретение обеспечивает повышение технологичности способов получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса, используемого в фармацевтической промышленности, медицине в качестве компонента медицинских изделий. 5 пр.

Способ получения карбоксиметилхитин-глюканового комплекса, состоящий из обработки гидроксидом натрия хитинового сырья в среде изопропилового спирта с перемешиванием, обработки алкилирующим агентом в среде изопропилового спирта, разделения реагентов, нейтрализации твердой фазы кислотой и промывки экстрагентом до отсутствия щелочи и хлорид-ионов, сушки, отличающийся тем, что в качестве хитинового сырья используют хитин-глюкановый комплекс из биомассы мицелия высших грибов Armillaria mellea, который обрабатывают гидроксидом натрия в среде изопропилового спирта при соотношении хитинового сырья : гидроксида натрия как 1,0:0,58 (масс.) и при соотношении хитинового сырья : изопропилового спирта как 1,0:7,86 (масс.), проводят обработку ультразвуком мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 10-30 мин, добавляют алкилирующий агент – монохлорацетат натрия при соотношении хитиновое сырье : алкилирующий агент 1,0:1,7 (масс.), проводят обработку ультразвуком мощностью 161 Вт с частотой 28 кГц в течение 10-30 мин, нейтрализуют, промывают смесью этилового спирта и уксусной кислоты и высушивают.