СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛОВ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/28 G01N33/50 

Изобретение относится к области анализа, а именно к способам ферментативного определения фенолов и может быть использовано как в лабораторной практике и научных исследованиях, так и для определения этих токсических соединений в природных и сточных водах почве и т.п.

Известен способ (1) ферментативного определения (0,05-0,4 мМ) фенола, заключающийся в образования ярко окрашенных соединений лакказы с фенолом в присутствии 2,6-дибромо-4-аминофенола или 4-аминоантипирина и последующем фиксировании поглощения продуктов реакции спектрофотометрическим методом. Указанный способ неселективен, достаточно сложен, в работе (1) отсутствуют метрологические характеристики.

Наиболее близким к предлагаемому (прототипом) является способ (2), заключающийся в том, что к анализируемой пробе последовательно добавляют буферный раствор (рН 7,0) 0,1% раствор бензидина, 0,01 М раствор пероксида водорода, 1% раствор пероксидазы хрена. Содержание фенола определяют спектрофотометрически по временной зависимости поглощения при λ_max продукта реакции. Прямолинейная зависимость поглощения от концентрации фенола соблюдается в интервале 2-12 мкг/мл фенола. Нижняя граница определяемых концентраций фенола в работе (2) не приводится.

Задачей изобретения является разработка чувствительного способа определения не только фенола, но и его производных, а именно резорцина, пирокатехина, гидрохинона, пирогаллола в широком диапазоне определяемых концентраций.

Поставленная задача решается тем, что в ферментативном способе определения с использованием пероксидазы в качестве субстрата-восстановителя используют о-дианизидин в концентрации 5•10^-5-1•10^-4 моль/л. при этом в качестве ферментного препарата можно использовать как пероксидазу из растений (люцерны, хрена), так и грибную пероксидазу. В частности, пероксидаза из гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686 позволяет достичь самой высокой чувствительности (таблица).

При использовании о-дианизидина в качестве субстрата восстановителя прямолинейная зависимость поглощения от концентрации фенолов соблюдается в диапазоне для фенола 1-1000 мкг/мл, резорцина 0,3-1000 мкг/мл, гидрохинона 0,1-1000 мкг/мл, пирогаллола 0,05-1000 мкг/мл, пирокатехина 0,02-1000 мкг/мл, т. е. возможно определение указанных соединений в широком интервале концентраций. Кроме того, способ позволяет определять до 0,1 мкг/мл гидрохинона, пирогаллола и пирокатехина в присутствии до 10 мкг/мл фенола и резорцина, т.е. при их десятикратном избытке.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. В стеклянную пробирку с притертой пробкой вводят последовательно 7 мл трис-буферного раствора (рН 7,0), 0,2 мл 1,5•10^-6 М раствора пероксидазы гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686, 0,2 мл 5•10^-3 М раствора о-дианизидина, 0,1 мл анализируемой пробы, содержащей фенол, воду до объема реакционной смеси 10 мл и 0,2 мл 1•10^-1 М раствора Н₂O₂. В момент смешения растворов включают секундомер и измеряют оптическую плотность растворов через каждые 15 сек в течение 2 мин. Скорость реакции характеризуют тангенсом угла наклона кинетических прямых в координатах оптическая плотность время (tgα). Градуировочный график строят в координатах концентрация фенола.

При концентрации фенола 1 мкг/мл обнаружено (0,9±0,2) мкг/мл при стандартном отклонении 0,28.

Пример 2. В стеклянную пробирку с притертой пробкой вводят последовательно 7 мл трис-буферного раствора (рН 7,0), 0,2 мл 5•10^-7 М раствора пероксидазы из люцерны, 0,2 мл 2,5•10^-3 М раствора о-дианизидина. 0,1 мл анализируемой пробы, содержащей резорцин, воду до общего объема реакционной смеси 10 мл и 0,2 мл 2,5•10^-2 М раствора Н₂O₂. В момент смешения растворов включают секундомер и поступают далее так, как в примере 1.

При концентрации резорцина 1 мкг/мл обнаружено (1,1±0,2) мкг/мл при стандартном отклонении 0,17.

Пример 3. Условия как в примере 1, за исключением того, что анализируемая проба содержит гидрохинон (или пирогаллол, или пирокатехин), а после смешения компонентов реакционной смеси измеряют оптическую плотность каждые 15 сек, фиксируя начало резкого увеличения скорости реакции, совпадающее с окончанием индукционного периода t_инд Градуировочный график строят в координатах τ_инд концентрация определяемого соединения.

При концентрации гидрохинона 0,1 мкг/мл обнаружено (0,09±0,03) мкг/мл при стандартном отклонении 0,19; пирокатехина 0,1 мкг/мл - (0,09±0,02) мкг/мл при стандартном отклонении 0,16; пирогаллола 0,1 мкг/мл (0,1±0,03) мкг/мл при стандартном отклонении 0,20.

Пример 4. Условия как в примере 3.

а) Вводят 0,2 мкг/мл гидрохинона, получают τ_инд 160 сек.

б) вводят 0,2 мкг/мл гидрохинона и 20 мкг/мл фенола. Получают τ_инд 160 сек, что свидетельствует о том, что возможно определение гидрохинона в присутствии 100-кратного избытка фенола.

Использование: область анализа, относится к способу ферментативного определения фенолов. Сущность применения: последовательно к буферному раствору добавляют раствор пероксидазы, о-дианизидина, анализируемую пробу и раствор пероксида водорода и регистрируют спектрофотометрически поглощение образовавшегося продукта реакции. Используют пероксидазу из растений и грибов, в частности, штамма Phellinus igniarius ВКПМ F-686. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ ферментативного определения фенолов, предусматривающий последовательное смешивание растворов пероксидазы, субстрата-восстановителя, анализируемой пробы, пероксида водорода с последующей спектрофотометрической регистрацией поглощения продукта реакции, отличающийся тем, что в качестве субстрата-восстановителя используют О-дианизидин в концентрации 5•10^-5 1•10^-4 моль/л. 2. Способ по п.1 отличающийся тем, что используют пероксидазу из растений или грибов. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что используют пероксидазу гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686.