СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/385 

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано как при трансплантации органов и тканей человека, так и в перспективе при лечении онкологических больных.

Известно, что обычные трансплантации, даже с предподготовкой, приводят к следующим осложнениям:
1) отторжению пересаженного органа (что в случае с жизненноважными органами может привести реципиента к летальному исходу);
2) изменению иммунологического статуса больного из-за реакций - трансплантат против хозяина или хозяин против трансплантата, что в свою очередь приводит к возникновению различных осложнений и вторичных инфекций, с которыми организм уже не может справиться;
3) токсическому поражению органов (сердце, печень, почки) реципиента, а также самого трансплантата в результате проводимой "медикаментозной защиты трансплантата" с целью достижения торможения его отторжения.

Известны способы трансплантации островков поджелудочной железы при диабете, когда с целью торможения отторжения аллогенных тканей реципиенту (человеку) вводили раствор человеческого антитимоцитарного глобулина, например: \Hu Y.-F., Gu Z.F., Zhang H.D. et al. "lslet transplantation in patients with type i diabetes in China." ("Diabetes" 1989, vol. 38 Suppl. 1 p. 316).

Недостатком метода является нарушение системы иммунологического распознавания у реципиента, кратковременность действия такой "защиты" для пересаженных тканей и нарушения со стороны свертывающей системы крови.

Все достижения науки в области торможения отторжения трансплантатов используют при аллогенных трансплантациях костного мозга. Так, в работе Filipovich A. H. и др. /Filipovich A.H., Shapiro R.S., Ramsay N.K.C. at al./ "Unrelated Donor Bone Marrow Transplantation for Correction of Lethai Congenital immunodeficiencies." ("Biood" 1992, vol. 80, N 1, p. 270-276) показаны результаты трансплантации аллогенного костного мозга 12 детям с тяжелым комбинированным иммунодефицитом.

Все пациенты, кроме одного ребенка, получали поддерживающую химиотерапию и/или радиотерапию до инфузии аллогенного костного мозга (приблизительно за 6-7 дней до трансплантации), как профилактическую предподготовку против отторжения. Доноры для 3 пациентов были фенотипически подобраны по всем HLA-A, B, Dr, Dw loci локусам, 9 других доноров были слабо совместимы с реципиентом и четко подбирались лишь по одному локусу HLA-A или B и Dw loci. После проведенной трансплантации всем больным проводилась профилактика реакции трансплантат - против хозяина, которая включала в себя дачу метотрексата и преднизона в сочетании с циклоспорином-A (6 пациентов), антитимоцитарного глобулина (5 пациентов) или анти-CD5 иммунотоксина с А-цепью рицина (1 пациент).

Иммунологическое восстановление (приживление аллотрансптантата) было отмечено у 10 больных, однако, через 1-3 года и у них произойдет отторжение и больные погибнут (средняя продолжительность их жизни - около 2 лет после трансплантации) и это при возрасте больных от 3 месяцев до 8 лет! Авторы обращают внимание и на тот факт, что несмотря на все предпринятые усилия врачей, у двух больных наблюдались тяжелые инфекционные осложнения, которые привели больных к гибели в более ранние сроки.

Этот способ выбран нами в качестве прототипа и имеет следующие недостатки.

1. Необходимость побора гистосовместимого донора, хотя бы по одному локусу HLA.

2. Применение химио- и/или радиотерапии в качестве "предподготовки" реципиентов за 6-7 дней до трансплантации, что приводит дополнительно к поражению клеток крови и клеток желудочно-кишечного тракта.

3. Использование сильных иммуносупрессоров, способных нарушить клеточное деление, таких как циклоспорин-А, метотрексат и др.

4. Удаление иммунокомпетентных клеток (Т-ряда) антитимоцитарным глобулином или анти-CD5 иммунотоксином с A-цепью рицина у реципиентов. Эта манипуляция приводит к нарушению межклеточных взаимодействий и ослабляет антиинфекционную защиту организма.

5. Крайне низкая продолжительность "жизни" детей (около 2 лет) после таких сложных и опасных для детского организма процедур.

Цель предлагаемого способа - устранение указанных выше недостатков. Поставленная цель достигается тем, что в способе трансплантации органов и тканей путем проведения реципиенту предподготовки с последующей собственно пересадкой соответствующих органов и тканей в стадии предподготовки у реципиента выделяют эритроциты крови, которые затем нагружают антигенами гистосовместимости первого класса, полученными от донора, парэнтерально вводят реципиенту эти нагруженные эритроциты, а в стадии собственно пересадки используют того же донора.

В предлагаемом способе успех трансплантации органов и тканей достигается при полном сохранении иммунной системы реципиента как до, так и после трансплантации, абсолютно безопасной для него предподготовки (что клинически подтверждено) и отсутствием необходимости тщательного подбора донора.

Предлагаемый способ состоит в следующем.

1. Предподготовка, когда у реципиента берут из вены кровь (у человека приблизительно 5-10 мл). Выделяют эритроциты. Одновременно от доноров трансплантируемой ткани или органов обычным способом выделяют растворимые антигены гистосовместимости 1 класса, например, по способу Строминжера (Strominger J.L./Structure of products of the major histocompatibility complex in man and mouse/Prog. Immunol., N 4, p. 541-554 1980), которыми затем и "нагружают" эритроциты реципиента. (Существуют различные способы "нагрузки" клеток чужеродными антигенами - так, например, "соединяли" эритроциты вола и моноклональные антитела / Berthold F., Schumacher R., Schneider A., et al./ Removal of neuroblastoma cells from bone marrow by a direct monoclonal antibody rosetting technique/ Bone Marrow Transplantation 4, 273-278, 1989). Затем, такие "нагруженные" эритроциты вводят реципиенту, для иммунной системы которого не только сами эритроциты, но и все захваченные ими антигены (в том числе и растворимые антигены гистосовместимости 1 класса доноров) станут восприниматься как "свои", так как теперь они не пойдут по эндосомальному пути, характерному для всех экзогенно попавших антигенов, а будут восприниматься как "внутренние", эндогенные антигены, против которых не должны вырабатываться антитела.

2. Осуществление собственно трансплантации клеток или тканей от неродственного донора. Эту процедуру проводят по обычным отработанным методикам через 7 дней после осуществления предподготовки.

Предлагаемый способ позволяет преодолеть барьеры гистосовместимости не только между двумя генетически близкими видами организмов, при сохранении иммунитета реципиента, что было продемонстрировано в эксперименте, но и осуществить в клинике ксенотрансплантацию островков поджелудочной железы от взрослого кролика больным с тяжелой формой сахарного диабета. Предположительно, это может быть связано с тем, что после проведения предподготовки антигены гистосовместимости будущего донора будут экспрессированы не с антигенами гистосовместимости второго класса, что характерно для всех экзогенно поступивших "чужих" антигенов, а минуют эндосомальный путь в иммунокомпетентных клетках и будут экспрессироваться, как "свои", внутренние антигены, с комплексом гистосовместимости первого класса. Это и должно привести к последующему приживлению трансплантируемого органа или ткани.

Пример 1. Осуществление аллогенной трансплантации мышиной гибридомы ИКО 31, (которая пассируется исключительно на мышах Balb/c) на мышей - гибридах F₁(CBA • C₅₇BL/6).

От самцов F₁(CBA • C₅₇BL/6j) проводили забор крови. По обычной методике выделили фракцию эритроцитов. Конечный объем - 1,5 мл. Выделяли растворимые антигены гистосовместимости 1 класса от мышей Balb/c и нагружали ими эритроциты самцов F₁(CBA • C₅₇BL/6j). К ним добавляли 9 мл среды 199 и все это вводили внутрибрюшинно (в/б) по 1 мл 10 мышам F₁(CBA • C₅₇BL/6j).

Спустя 7 суток обработанным таким образом гибридам F₁(CBA • C₅₇BL/6j) вводили внутрибрюшинно по 15 млн. клеток гибридомы ИКО 31, (пассируемых исключительно на мышах линии Balb/c) в объеме 3,5 мл.

В качестве контроля использовали необработанных самцов F₁(CBA • C₅₇BL/6j) и обычных для этой гибридомы самок Baib/c. Им тоже вводили по 15 млн. клеток гибридомы ИКО 31 в/б в объеме 3,5 мл.

Через 10 дней (как обычно) у всех самок Balb/c развился асцит и они стали погибать (положительный контроль). У всех, предварительно обработанных самцов F₁(CBA • C₅₇BL/6j) асциты стали появляться лишь через 20 дней после начала эксперимента (опытная группа), они были проверены в лаборатории А.Ю. Барышникова (Онкологический Научный Центр РАМН), где было показано, что это действительно гибридомные клетки ИКО 31 и они работают в разведении 1:10000. У контрольных же мышей (отрицательный контроль) не отмечалось каких-либо отклонений со стороны внутренних органов весь период наблюдения (7 месяцев). (Данные представлены в таблице).

Авторы продолжили эксперимент, и взяв асцитные клетки, выросшие в мышах-гибридах F₁ (CBA • C₅₇BL/6j), снова перевили их на самок Balb/c и на необработанных F₁ (CBA • C₅₇BL/6j). Как и ожидалось, через 10 дней у всех самок появились асциты и через 5 дней они погибли, в то время как у необработанных мышей-гибридов F₁ (CBA • C₅₇BL/6j) опухоли не развились и через 7 месяцев (период наблюдения) и никаких отклонений во внутренних органах у них не обнаружили. Это еще раз подтверждало чистоту проведенного ранее эксперимента.

Пример 2. Осуществление ксеногенной трансплантации человеку островков поджелудочной железы от взрослого кролика.

Работа проведена на базе НИИТ и ИО (Научно-исследовательский институт трансплантации и искусственных органов) на больных с тяжелой формой сахарного диабета.

Больной И. 38 лет. Диагноз: сахарный диабет, тяжелая форма, тип 1 лабильный. Диабетическая полинейропатия, ангиопатия нижних конечностей, сетчатки обеих глаз. Страдает данным заболеванием с 14 лет. Больному были проведены в 1985, 1986, 1990, 1991, 1994 годах трансплантации клеток поджелудочной железы от новорожденных кроликов.

У больного из локтевой вены забирали кровь - 8 мл. Выделяли эритроциты. От конкретного кролика (для каждого больного - свой) выделяли растворимые антигены гистосовместимости 1 класса. Соединяли с эритроцитами (конечный объем смеси около 6 мл). И такие "нагруженные" эритроциты в объеме 6 мл (около 50000000 эритроцитов) вводили под защитой раствора новокаина в прямую мышцу живота. Это введение не вызвало никаких осложнений у больного (свертывающая-противосвертывающая системы крови, функция почек, сердца, печени и т.д.) отсутствовали и аллергические проявления. Спустя 7 дней этому больному была осуществлена трансплантация островков поджелудочной железы, предварительно прокультивированных по методике Н.Н. Скалецкого (лаборатория культур тканей НИИТ и ИО) 2 суток.

Через 2 месяца после проведения трансплантации ее эффективность оценена как положительная (для сравнения - у данного больного, после проведения 5 трансплантации в 1994 году, уже через 3 недели отмечено отторжение пересаженных тканей), так у больного прошли нейропатии нижних и верхних конечностей потребность в экзогенном инсулине снижена более, чем на 50%, причем отмечена резко возросшая чувствительность к такому инсулину. Применение предложенного способа не вызвало у пациента никаких отрицательных изменений ни со стороны крови, ни со стороны функции почек, сердца или печени. У больного стали наблюдаться "ночные гипогликемические состояния", которые, как правило, в дальнейшем приводят к полному отказу от экзогенного инсулина. Больной работает, у него пропала необходимость в "отдыхе" после любой физической нагрузки, а свое состояние субъективно оценивает как "отличное". Причем все это достигнуто в более короткие сроки, по сравнению с обычными трансплантациями островков поджелудочной железы, полученных от новорожденных кроликов.

Пример 3. Больная Л., 45 лет. Диагноз: сахарный диабет, тяжелая форма с нарушениями функции печени, ангиопатия верхних и нижних конечностей. Страдает диабетом 25 лет. В анамнезе - коматозные состояния. Трансплантации островков поджелудочной железы ранее не проводились.

У больной из локтевой вены забирали кровь - 8 мл. Выделяли эритроциты. От конкретного кролика (Для каждого больного - свой) выделяли растворимые антигены гистосовместимости 1 класса. Соединяли с эритроцитами (конечный объем смеси около 6 мл). И такие "нагруженные" эритроциты в объеме 6 мл (около 50000000 эритроцитов) вводили под защитой раствора новокаина в прямую мышцу живота. Это введение не вызвало никаких осложнений у больной (свертывающая-противосвертывающая системы крови, функция почек, сердца, печени и т. д.) отсутствовали и аллергические проявления. Спустя 7 дней этой больной была осуществлена трансплантация островков поджелудочной железы, предварительно прокультивированных по методике Н.Н. Скалецкого (лаборатория культур тканей НИИТ и ИО) 2 суток.

Через 2 месяца после проведения трансплантации ее эффективность оценена как положительная. У больной прошли нейропатии, на 50% снижена потребность в экзогенном инсулине. Отмечены улучшения со стороны функции печени. Больная работает и по настоящее время (отказалась от "открытого больничного листа").

Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что метод является универсальным, пригоден как для аллогенных, так и ксеногенных трансплантаций, а иммунологически является совершенно безопасным.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в трансплантологии, и обеспечивает сохранение иммуной системы реципиента как до, так и после трансплантации и проведение трансплантации в более сжатые сроки. Реципиенту проводится предподготовка с последующей собственно пересадкой органов и тканей. При этом в стадии предподготовки у реципиента выделяют эритроциты крови, которые затем нагружают антигенами гистосовместимости первого класса, полученными от донора, парэнтерально вводят реципиенту эти нагруженные эритроциты, а в стадии собственно пересадки используют того же донора. 1 табл.

Способ трансплантации органов и тканей путем проведения реципиенту предподготовки с последующей собственно пересадкой соответствующих органов и тканей, отличающийся тем, что в стадии предподготовки у реципиента выделяют эритроциты крови, которые затем нагружают антигенами гистосовместимости первого класса, полученными от донора, парэнтерально вводят реципиенту эти нагруженные эритроциты, а в стадии собственно пересадки используют того же донора.