СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ Т-ЗАВИСИМОГО ИММУНОДЕФИЦИТА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к диагностике нарушений в иммунной системе организма.

Известны способы выявления иммунодефицитов, основанные на определении количественных и функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток - лимфоцитов (Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. М. , 1990, с. 27), заключающиеся в идентификации лимфоцитов и определении их ответа на различные митогены и антигены.

Недостатками этих способов являются длительность и сложность технологического процесса.

Наиболее близким способом, выбранным в качестве прототипа, является способ определения T-зависимого иммунодефицита по количественным характеристикам T-лимфоцитов, заключающийся в выделении их из крови с помощью фиколл-верографина или других веществ, добавлении к клеткам моноклональных антител и меченных антител к моноклональным антителам, приготовлении препаратов и в подсчете количества тех или иных клеток под микроскопом (Лимфоциты. Методы. / Под ред. ДЖ.Клауса. М.: Мир, 1990, с. 112 - 175).

Недостатками прототипа являются длительность процесса, вызванная множеством операций, на которые затрачивается не менее 6 - 7 ч, сложность в их проведении, большие трудозатраты, необходимость в значительных количествах крови (5 мл) и непригодность в силу этих причин для массового обследования населения.

Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе используют кровь пациента и меченные антитела, согласно изобретению определяют антитела - иммуноглобулины класса G - к гормону тимуса в сыворотке крови пациента, и при повышенном их уровне по сравнению с уровнем антител - иммуноглобулинов класса G - к гормону тимуса в серонегативной контрольной сыворотке выявляют T-зависимый иммунодефицит.

Таким образом, сущность изобретения заключается в том, что определяют в сыворотке крови пациента наличие антител к гормону тимуса. В данном способе выявляют антитела - иммуноглобулины класса G. Для количественной оценки уровня антител к гормону тимуса используют либо оптически плотную метку, например меченные пероксидазой хрена антитела против IgG человека, либо радиоактивно меченные антитела против IgG человека (Иммунологические методы. / Под ред. Г. Фримеля. М.: Медицина, 1987, с. 157 - 163). Продукт реакции с меченными пероксидазой хрена антителами против IgG человека определяют фотометрически, а продукт реакции с радиоактивно меченными антителами к IgG человека определяют радиометрически. При повышенном уровне антител к гормону тимуса в сыворотке крови пациента по сравнению с уровнем антител к гормону тимуса в серонегативной контрольной сыворотке выявляют T-зависимый иммунодефицит.

Способ реализуют следующим образом.

В лунки полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят 100 мкл раствора гормона тимуса (тимогена или T-активина) - концентрация 40 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере с pH 9,2. Планшеты помещают в термостат на 1 ч при 37^o, удаляют раствор, промывают забуференным физиологическим раствором с детергентом. После этого в лунки вносят сыворотки пациентов и серонегативную контрольную сыворотку, помещают планшет в термостат на 1 ч при 37^o, отмывают забуференным физиологическим раствором с детергентом. Вносят антитела, меченные пероксидазой хрена против иммуноглобулинов класса G человека в рабочем разведении (1:1000 или 1:2000), помещают в термостат на 1 ч при 37^o, затем отмывают забуференным физиологическим раствором с детергентом и вносят в лунку 100 мкл субстрата - 0,01% раствор ортофенилендиамина в смеси с метанолом, цитратом натрия и перекисью водорода. Планшет выдерживают в темном месте до появления желтой окраски. После этого реакцию останавливают внесением 50 мкл 1 М серной кислоты. Производят определение оптической плотности продукта реакции. Подсчитывают коэффициент K = D₀/D_к, где D₀ - оптическая плотность продукта реакции с сывороткой пациента, D_к - оптическая плотность продукта реакции с серонегативной контрольной сывороткой. При K ≥ 1,20, что соответствует превышению оптической плотности продукта реакции сыворотки пациента на 20% и более над оптической плотностью продукта реакции серонегативной контрольной сыворотки, выявляют T-зависимый иммунодефицит. Продукт реакции между гормоном тимуса и сывороткой крови можно определить и радиометрическим путем (см. ссылку). Точка отсчета 20% взята потому, что в 19,9% входят объективные (погрешности сети, приборов, качество материалов и т. п.) ошибки и субъективные (погрешности в работе лаборанта) ошибки.

При реализации предложенного способа требуется всего 1 мл крови. Полученная из этого объема сыворотка разводится в 100 раз, затрачивается около 4 ч времени. Одновременно можно обследовать 30 - 300 человек в день, допускается хранение сыворотки в замороженном виде, чего нельзя делать при исследованиях по прототипу. При реализации прототипа требуется не менее 5 мл крови, затрачивается не менее 6 часов на обследование максимум 6 человек, кровь не подлежит консервации и хранению.

В таблице приведены результаты обследования пациентов по прототипу и предлагаемому способу.

Как видно из таблицы, только определение согласно предлагаемому способу АТ к гормону тимуса - иммуноглобулинов класса G дает, во-первых, соответствие с показателями прототипа, во-вторых, подтверждает, что АТ относятся к классу G.

Приводим результаты обследования пациентов предложенным способом и по прототипу.

1. Т-а. Результаты исследования по предложенному способу до лечения: с тимогеном - K = 1,70; с T-активином - K = 1,53. Иммунный статус по прототипу: все T-лимфоциты - 32%, зрелые T-лимфоциты - 28%, T-хелперы/индукторы - 10%, T-супрессоры/цитотоксические лимфоциты - 8%. Отмечается выраженный T-зависимый иммунодефицит.

Результаты исследования после лечения: по предложенному способу с тимогеном - K = 1,33, с T-активином - K = 1,33; по прототипу: все T-лимфоциты - 60%, зрелые T-лимфоциты - 50%, T-хелперы/индукторы - 44%, T-супрессоры/цитотоксические лимфоциты - 32%. В результате лечения у пациента отмечается тенденция к нормализации показателей.

2. У-ц. Результаты исследования по предложенному способу: с тимогеном - K = 1,50, с T-активином - K = 1,42; по прототипу: все T-лимфоциты - 32%, зрелые T-лимфоциты - 28%, T-хелперы/индукторы - 26%, T-супрессоры/цитотоксические лимфоциты - 38%. У пациента T-зависимый иммунодефицит.

3. Л-в. Результаты исследования по предложенному способу: с тимогеном - K = 1,49, с T-активином - K = 1,54. По прототипу: все T-лимфоциты 52%, зрелые T-лимфоциты - 40%, T-хелперы/индукторы - 34%, T-супрессоры/цитотоксические лимфоциты - 16%. Отмечается до лечения T-зависимый иммунодефицит. Результаты после лечения: по предложенному способу с тимогеном - K = 1,35, с T-активином - K = 1,26; по прототипу: все T-лимфоциты - 78%, зрелые T-лимфоциты - 70%, T-хелперы/индукторы - 47%, T-супрессоры/цитотоксические - 38%. Отмечена тенденция к нормализации показателей после лечения.

4. Л-х. Результаты исследования по предложенному способу: с тимогеном - 0,89, с T-активином - 0,94. По прототипу: все T-лимфоциты - 68%, зрелые T-лимфоциты - 59%, T-хелперы/индукторы - 46%, T-супрессоры/цитотоксические - 44%. При низких значениях K показатели T-клеточного звена иммунитета в норме.

Таким образом, предложенный способ позволяет сократить время выявления T-зависимого иммунодефицита, упростить технологический процесс, снизить трудозатраты, использовать малый объем крови, проводить массовое обследование населения.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии, и может применяться в диагностике нарушений в иммунной системе организма. Исследуют кровь пациента с помощью меченных антител. Определяют антитела - иммуноглобулины класса G - к гормону тимуса в сыворотке крови пациента и при повышенном уровне по сравнения с уровнем антител - иммуноглобулинов G - к гормону тимуса в серонегативной сыворотке (контрольной) выявляют Т-зависимый иммунодефицит. Способ обеспечивает проведение массовых обследований, упрощает технологический процесс, снижает трудозатраты, сокращает время исследования. 1 табл.

Способ выявления Т-зависимого иммунодефицита, включающий использование крови пациента и меченных антител, отличающийся тем, что определяют антитела - иммуноглобулины G - к гормону тимуса в сыворотке крови пациента и при их повышенном уровне по сравнению с уровнем антител к гормону тимуса в серонегативной контрольной сыворотке выявляют Т-зависимый иммунодефицит.